田晨雪　劉明　黃開耀

摘要：為了更經(jīng)濟(jì)、有效地處理豬場沼液，采用微藻凈化沼液的方法，通過一株蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）對10%豬場沼液稀釋液為期18 d的凈化，全面檢測沼液在凈化過程中不同時期、不同指標(biāo)的變化情況。結(jié)果表明，蛋白核小球藻可在消毒后的沼液稀釋液中存活且具有較好生長狀態(tài)，OD680 nm最高可達(dá)1.206、相對生長速率最高可達(dá)0.208 0。經(jīng)過蛋白核小球藻凈化后，沼液中總氮、總磷、銨態(tài)氮含量去除率分別為61.89%、99.72%、96.79%；硝態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮含量有所上升；COD含量變化曲線呈波動情況。證明了蛋白核小球藻凈化豬場沼液的可行性。

關(guān)鍵詞：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）；沼液；總氮；總磷；銨態(tài)氮

中圖分類號：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）18-0039-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.009 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Purification of A Biogas Slurry of Chlorella pyrenoidosa

TIAN Chen-xue1，LIU Ming2，HUANG Kai-yao3，JIANG Si-wen1，4，GAO Qi-shuang2，MIAO Wen5

（1.College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Wuhan Academy of Agricultural Sciences and Technology，Wuhan 430208，China；3.Key Laboratory of Algae Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072，China；4.Hubei Pig Health Aquaculture Collaborative Innovation Center，Wuhan 430070， China；5.Wuhan COFCO Meat Products Co. Ltd.，Wuhan 430070，China）

Abstract： In order to treat biogas slurry more economically and effectively， microalgae was used to purify biogas slurry. The aim was to fully detect the changes of biogas slurry at different times and different indexes during purifying 10% diluted biogas slurry by a Chlorella pyrenoidosa for 18 days. The results showed that the algae chlorella pyrenoidosa could survive in the biogas slurry after disinfection and had a good growth status whose highest OD680 nm could reach 1.206，highest relative growth rate could reach 0.208 0. The removal rates of total nitrogen，total phosphorus and ammonium nitrogen in biogas slurry were 61.89%，99.72% and 96.79%，respectively； The contents of NO3--N and NO2--N increased a little； And COD content showed a fluctuation curve. The feasibility of purifying the biogas slurry by C. pyrenoidosa was proved.

Key words： Chlorella pyrenoidosa； biogas slurry； total nitrogen； total phosphorus； ammonium nitrogen

隨著中國經(jīng)濟(jì)、社會的發(fā)展，集約化養(yǎng)殖的廣泛實施帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。有報道指出，畜牧業(yè)是面源污染的絕對主體[2]。2014年畜禽廢水產(chǎn)生量約為30億t，所含COD、P、N總量分別達(dá)1 268.26萬、16.04萬、102.48萬t[3]，其中大部分來源于生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。目前對養(yǎng)豬廢水的主要處理方式是“種養(yǎng)結(jié)合”，但實際90%以上的養(yǎng)豬企業(yè)沒有足夠的種植基地，造成大量養(yǎng)豬廢水無法徹底消納，蘊含著極其嚴(yán)重的污染隱患。

為了更經(jīng)濟(jì)有效地處理養(yǎng)殖廢水，20世紀(jì)50年代，人們開始探索微藻凈化技術(shù)，并取得長足進(jìn)展。馬紅芳等[4]的研究中月牙藻對總氮的去除率為72.5%；陳香元[5]利用小球藻處理養(yǎng)豬沼液銨態(tài)氮、總氮、總磷去除率分別為88.27%、85.04%、41.56%；程海翔[6]研究表明，利用柵藻處理養(yǎng)豬糞水銨態(tài)氮、總氮和總磷的去除率分別為97.3%、87.9%和93.2%。中國臺灣地區(qū)已普遍利用藻類凈化豬場沼液。微藻可以利用廢水中的氮、磷等元素[7]，也是開發(fā)前景良好的原材料[8]。該技術(shù)符合中國養(yǎng)豬廢棄物資源化利用國策，值得大力研究與推廣。

由于蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）處理豬場沼液的研究較少，本試驗在豬場沼液中培養(yǎng)蛋白核小球藻，并在此過程中持續(xù)監(jiān)測多項水質(zhì)指標(biāo)及其生長狀態(tài)，為工廠化生產(chǎn)應(yīng)用該藻種凈化養(yǎng)豬廢水提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藻種 蛋白核小球藻來自于武漢凈宇微藻科技有限公司。

1.1.2 試驗沼液 豬場沼液取自湖北省武漢市中糧肉食有限公司大冶養(yǎng)豬場。沼液預(yù)處理：四層300目紗布過濾，去除固體懸浮物。將沼液用自來水配制為10%沼液稀釋液。按照0.015 g/L的用量在沼液稀釋液中加入強(qiáng)氯精充分溶解混勻進(jìn)行消毒18 h；加入硫代硫酸鈉充分溶解混勻中和曝氣1 h，備用。將消毒好的廢水分別分裝于5 L血清瓶中（圖1）。

1.2 主要儀器

UV754N系列紫外可見分光光度計，ACO系列電磁式空氣泵，AUY120分析天平，YXQ-LS-50S-Ⅱ立式壓力蒸氣滅菌器，PHSJ-3F pH計等。

1.3 方法

1.3.1 藻種培養(yǎng) 用蛋白核小球藻先在BG11培養(yǎng)基（表1）中擴(kuò)培，至蛋白核小球藻在680 nm處的光密度值（OD680 nm）為0.900左右時，將蛋白核小球藻接種至豬場沼液進(jìn)行持續(xù)篩選，直至蛋白核小球藻可在沼液中生長值達(dá)到OD680 nm為0.900左右。

1.3.2 藻種接種 當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟逶谡右褐猩L值達(dá)到OD680 nm為0.900左右時，8 000 r/min離心5 min后收集藻細(xì)胞。將藻細(xì)胞接種于提前消毒好的沼液稀釋液中，接種比例為1∶10。

1.3.3 培養(yǎng)條件 將接種好的微藻置于溫度（27±1） ℃中，光照度為2 000 lx，光暗比為14∶10，24 h連續(xù)曝氣。試驗周期為18 d。每3 d測定1次藻細(xì)胞生長狀況，取樣同時測定OD680 nm、pH，所有樣品采集結(jié)束后測定沼液的水質(zhì)指標(biāo)。

1.3.4 微藻生長測定及分析 已有研究表明培養(yǎng)液中微藻的細(xì)胞密度與其在680 nm處光密度值呈線性相關(guān)[9]，因此用紫外可見分光光度計（UV754N，上海儀電分析儀器有限公司）測定活體藻液在680 nm處的光密度值代表細(xì)胞密度，根據(jù)公式（1）計算微藻接種到沼液后1～18 d的相對生長速率：

K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1） （1）

其中，K為相對生長速率；t1、t2為對應(yīng)的培養(yǎng)時間；N1、N2分別為t1、t2時期藻液的OD680 nm。

1.3.5 沼液水質(zhì)測定及分析 每隔3 d所取樣品用于水質(zhì)指標(biāo)總氮（TN）、總磷（TP）、化學(xué)需氧量（COD）、氨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）以及亞硝態(tài)氮（NO2--N）的測定，測定均采用國家環(huán)境保護(hù)總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。總氮用GB11894-89堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，總磷用GB11893-89鉬酸銨分光光度法，化學(xué)需氧量用GB11914-89重鉻酸鉀法，氨態(tài)氮用GB7479-87納氏試劑比色法，硝態(tài)氮用HZ-HJ-SZ-0138紫外分光光度法，亞硝態(tài)氮用GB7493-87分光光度法。各水質(zhì)指標(biāo)去除率（r）根據(jù)公式（2）計算：

r=（C0-Ct）/C0×100% （2）

其中，C0為初始總氮、總磷等濃度，Ct為培養(yǎng)t天后的濃度（mg/L）。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。試驗計算及作圖由Graphpad Prism 5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻在沼液中的生長特性及pH的變化情況

每3 d測定1次蛋白核小球藻吸光度OD680 nm，結(jié)果如圖2所示。蛋白核小球藻在10%沼液稀釋液中長勢良好，OD680 nm快速上升直至15 d時生長減緩進(jìn)入平臺期。OD680 nm最高可達(dá)1.206。

測定沼液pH，變化情況見圖3。由圖3可知，隨著蛋白核小球藻對沼液的凈化，pH呈先下降后上升的趨勢，即酸性先增強(qiáng)后減弱，最終接近中性；而空白對照的pH呈先略微上升后下降至基本平穩(wěn)，總體變化程度較小。

2.2 蛋白核小球藻在沼液中的相對生長速率

蛋白核小球藻在沼液中的相對生長速率變化曲線如圖4所示。蛋白核小球藻3、6、9、12、15、18 d的相對生長速率依次為0.160 6、0.208 0、0.142 1、0.103 6、0.098 9、0.015 0。結(jié)果顯示，蛋白核小球藻在6 d時達(dá)到最高（0.208 0）；18 d時減緩至最低（0.015 0）；相對生長速率整體呈先上升后下降的趨勢。

2.3 蛋白核小球藻對沼液中總氮含量的影響

總氮含量變化曲線如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻對沼液中總氮含量的去除效果較好，去除率最高可達(dá)61.89%?？偟吭谇? d的下降最迅速，在3～15 d下降較為緩慢，甚至在18 d時總氮含量有所上升。蛋白核小球藻對沼液的去除率在15 d之前一直呈上升趨勢，在15 d后開始下降。

2.4 蛋白核小球藻對沼液中總磷含量的影響

總磷含量變化曲線如圖6所示，蛋白核小球藻對沼液中總磷的去除效果良好，18 d沼液中總磷含量僅為0.014 mg/L，去除率為99.72%。試驗過程中總磷含量保持持續(xù)穩(wěn)定下降?？偭缀康娜コ食掷m(xù)上升，直至18 d時達(dá)到最大，去除率為99.72%。

2.5 蛋白核小球藻對沼液中銨態(tài)氮含量的影響

銨態(tài)氮含量變化曲線如圖7所示，蛋白核小球藻對沼液中銨態(tài)氮的去除效果明顯，尤其是在蛋白核小球藻生長的前6 d。最終在18 d時，銨態(tài)氮含量下降至2.790 mg/L，去除率為96.79%?？梢钥闯鲈诘鞍缀诵∏蛟迳L前期銨態(tài)氮的去除情況相較于生長后期更為明顯。銨態(tài)氮的去除率在9 d前呈快速上升趨勢，之后進(jìn)入平臺階段。

2.6 蛋白核小球藻對沼液中硝態(tài)氮含量的影響

硝態(tài)氮含量變化曲線如圖8所示，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過蛋白核小球藻的沼液中，硝態(tài)氮的含量有所增加，且在培養(yǎng)過程中保持上升趨勢，但最終的硝態(tài)氮含量并非很高，為10.587 mg/L。

2.7 蛋白核小球藻對沼液中亞硝態(tài)氮含量的影響

亞硝態(tài)氮含量變化曲線如圖9所示，亞硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)出隨著蛋白核小球藻的生長逐漸升高的趨勢，18 d時亞硝態(tài)氮含量為39.337 mg/L，含量較高。

2.8 蛋白核小球藻對沼液中COD含量的影響

COD含量變化曲線如圖10所示，蛋白核小球藻對沼液中COD含量的去除無明顯效果。在試驗過程中，COD含量處于波動狀態(tài)，無明顯規(guī)律。這表明蛋白核小球藻不能有效去除沼液中的COD。

3 討論

3.1 沼液中蛋白核小球藻的生長特性

蛋白核小球藻的突出優(yōu)勢在于其能良好地適應(yīng)沼液這一惡劣的生長環(huán)境，耐性較強(qiáng)；在其他藻種無法存活的條件下，蛋白核小球藻可以達(dá)到較好生長狀態(tài)。且在生長過程中充分利用沼液中可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)，在生長的同時去除沼液中的營養(yǎng)物質(zhì)，凈化水質(zhì)。這一結(jié)果與很多研究者[7-9]的研究結(jié)果相符。

3.2 沼液不同氮素形態(tài)的變化情況

由于微藻中的蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)都是由碳、氮、磷等元素組成，因此藻細(xì)胞的生長繁殖離不開氮、磷等元素的吸收，恰恰沼液中富含豐富的營養(yǎng)成分，正好為藻細(xì)胞的生長提供基本的養(yǎng)料[11]。其中氮源是微藻可利用的重要元素之一。

未經(jīng)處理沼液中氮素的主要存在形式為銨態(tài)氮，在0 d時其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。經(jīng)過蛋白核小球藻凈化后的沼液，銨態(tài)氮含量明顯下降，表明蛋白核小球藻在不同氮素存在形式中優(yōu)先利用了銨態(tài)氮。本試驗中銨態(tài)氮去除率為96.79%，優(yōu)于陳香元[5]利用普通小球藻處理沼液的效果。在蛋白核小球藻生長的后期，硝態(tài)氮含量以及亞硝態(tài)氮含量逐漸上升，使得總氮含量在15 d之后又有所上升。這是由于亞硝態(tài)氮是藻體生長代謝過程中進(jìn)行銨態(tài)氮氧化和硝態(tài)氮還原的中間產(chǎn)物，有部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成為亞硝態(tài)氮。有研究表明較低濃度的亞硝態(tài)氮具有促進(jìn)微藻生長的作用，但濃度升高會抑制藻類生長[12]，顯然在蛋白核小球藻生長后期，亞硝態(tài)氮對其生長具有一定的抑制效果。

3.3 沼液中總磷的變化規(guī)律

有研究認(rèn)為，磷是一切藻類都必需的營養(yǎng)元素，常被認(rèn)為是第一位限制性營養(yǎng)元素[13]。本次試驗中，經(jīng)過蛋白核小球藻凈化的沼液最終總磷含量為0.014 mg/L，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅰ類水總磷要求；對總磷去除率達(dá)99.72%，高于程海翔[6]利用柵藻處理糞水沼液的去除率，這說明蛋白核小球藻在總磷去除效果上優(yōu)于柵藻。綜上所述，沼液中的大部分磷元素可作為營養(yǎng)物質(zhì)被蛋白核小球藻吸收利用。

3.4 蛋白核小球藻對沼液中COD含量的影響

目前國內(nèi)有關(guān)藻類對沼液中COD去除的相關(guān)研究較少，這是由于藻類對于沼液中COD的去除效果一般。本試驗旨在全面了解蛋白核小球藻凈化沼液后水質(zhì)變化情況，故測定了COD含量的變化曲線。推測COD含量的變化曲線呈現(xiàn)波動情況，可能是由于蛋白核小球藻生長過程中藻細(xì)胞的更新與代謝，造成了水體中有機(jī)物的不斷變化。

4 小結(jié)

本試驗證明了蛋白核小球藻可以在10%沼液稀釋液中存活且具有較好生長狀態(tài)。通過一株蛋白核小球藻對10%沼液稀釋液為期18 d的凈化，全面了解了沼液在凈化過程中不同時期、不同指標(biāo)的變化情況。在總氮、總磷、化學(xué)需氧量、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮的去除方面，蛋白核小球藻對總磷去除效果最好，其次為銨態(tài)氮、總氮。

綜上所述，蛋白核小球藻可作為后續(xù)沼液凈化的候選藻種；在微藻凈化廢水的同時資源化利用了其中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其自身的生物量，是一種環(huán)境友好型的廢水處理手段。這也為今后大容量藻類生物反應(yīng)器的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景和現(xiàn)實意義。

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