* 曉輝

1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000;2.蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215123

復方鵝絨藤藥方來源于臨床經(jīng)驗方，由戟葉鵝絨藤、白花菜子等6味藥材組成，主要用于肩周炎和腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性疼痛的治療。戟葉鵝絨藤[1](Cynanchumsibiricumwilld)為蘿藦科鵝絨藤屬的植物，是新疆特產(chǎn)藥材，多生于干旱及荒漠灰鈣土洼地，苦，涼，入心經(jīng)，具有化濕利水，祛風止痛的作用。白花菜子[2-3]為河北省習用藥材，性味苦、辛，溫，具有祛風除濕、活血止痛的功效，常用于治療風濕痹痛、跌打損傷及股骨頭壞死等病癥。此外，戟葉鵝絨藤具有生命力強、產(chǎn)量高的特點，是一種具有很高開發(fā)前景的新型藥用植物。本實驗采用小鼠熱板法、冰醋酸扭體法、二甲苯小鼠耳腫脹以及慢性肉芽腫四種動物模型探討復方鵝絨藤凝膠膏劑外用給藥的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學儀器廠)；電子天平SE602F(奧豪斯儀器上海有限公司)；ZH-YLS-68智能熱板儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI Rotaucpor R-200.BUCHI Heating Bath B-490)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)。

1.2 藥物 戟葉鵝絨藤采于新疆石河子市，經(jīng)石河子大學中藥學專家陳虹教授鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物戟葉鵝絨藤；消炎鎮(zhèn)痛膏(云南白藥集團股份有限公司)；0.9%生理鹽水注射液(新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司)；75%乙醇(天津市光復精細化工有限公司)；蒸餾水；0.6%醋酸。

1.3 動物 昆明種小鼠，清潔級，雌雄兼用，體重(20±2)g，購自新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心，合格證編號SCXK(新)2011-0003。動物飼養(yǎng)于標準環(huán)境:溫度(20～22℃),相對濕度(60～65)%,人工光照, 12 h明暗周期。

1.4 方法

1.4.1 有效部位提取及凝膠膏劑制備 分別稱取復方鵝絨藤處方中6味藥材3 kg，適度粉碎，置于大燒杯中，加濃度為75%的乙醇攪拌浸泡12 h，浸泡后置于圓底燒瓶內(nèi)，用10倍量濃度為75%的乙醇攪拌并加熱回流提取3次，每次2 h，取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，65℃以下減壓濃縮至黑褐色浸膏，出膏率為17.8%，進一步濃縮至相對密度為1.20～1.24(60℃)。

在提取出的復方鵝絨藤浸膏中按比例分別加入NP-700、卡波姆、甘羥鋁、酒石酸、甘油、氮酮、丙二醇涂布，放置成型，制得藥物凝膠膏劑。以小鼠腹部皮膚為滲透介質(zhì)，20%乙醇-生理鹽水為接收液，用改良Franz擴散池裝置測得所制藥物貼膏中總黃酮24 h累積滲透率為28.181%。

1.4.2 復方鵝絨藤凝膠膏劑對醋酸所致小鼠扭體的影響 選取小鼠60只，雌雄兼用，體重在(20±2)g，用電動剃毛器除去腹部被毛，隨機分為5組，每組12只，分別為模型對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。模型組小鼠腹部粘貼不含藥物的空白貼膏，陽性組粘貼消炎鎮(zhèn)痛膏，低、中、高劑量組分別粘貼的復方鵝絨藤凝膠貼膏規(guī)格分別為13 mg生藥/cm2、26 mg生藥/cm2、52 mg生藥/cm2，各組貼片均為圓形，直徑2 cm。實驗前用酒精棉擦拭小鼠腹部皮膚，之后各組貼膏粘貼于小鼠腹部皮膚，持續(xù)24 h，其間小鼠束足，24 h后除去貼片，解放小鼠束足，使小鼠充分活動30 min后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，之后立即記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，計算藥物的鎮(zhèn)痛百分率：

鎮(zhèn)痛百分率(%)=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%.

1.4.3 對小鼠熱板實驗的影響 雄性小鼠因受熱陰囊觸及熱板，可出現(xiàn)假性結(jié)果，本實驗采用雌性小鼠(20±2)g。于實驗前在(55±0.5)℃的恒溫水浴中放入玻璃燒杯，將小鼠放于其中，以小鼠舔后足為疼痛反應指標，測定每只小鼠的初始痛閾值。痛閾值在5～30 s內(nèi)為合格動物(即對熱敏感)。將痛閾合格的60只雌性小鼠隨機分為6組，每組12只，進行足部貼敷給藥，貼片直徑1 cm，給藥方法參照“1.2.2”，在 0.5 h、1 h、2 h、4 h按上述基礎痛閾值測定法分別測定各小鼠的痛閾值。超過40 s不舔足者按40 s計。記錄小鼠給藥前后痛閾值(s)，并進行統(tǒng)計分析。

1.4.4 小鼠耳腫脹實驗 篩選體重(20±2)g合格小鼠60只，雌雄兼用，貼片直徑8 mm，分組及給藥方法同“1.2.2”，每組12只。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，右耳貼敷給藥，結(jié)束給藥30 min后，于小鼠右耳前后兩面用20 μL二甲苯均勻涂抹，左耳不做任何處理，作為對照，2 h后將小鼠處死，分別在左、右耳同一部位用打孔器打下直徑為8 mm小鼠耳片，分別稱重，計算左、右耳片重量之差，用來評價炎癥腫脹程度，分別計算并記錄各給藥組的耳腫脹抑制率和腫脹率。計算方式如下：

腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100% ；腫脹率(%)=[右耳片重(g)-左耳片重(g)]/左耳片重(g)×100%。

1.4.5 慢性肉芽腫實驗 篩選體重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，麻醉后，于后肢一側(cè)腹股溝處切口，皮下植入已知重量的滅菌棉球，切口縫合，術(shù)后2 h開始給藥，貼片直徑1.5 cm，分組及給藥方法同“1.2.2”，每天更換新貼膏，連續(xù)給藥5 d，于第6d處死，取出棉球，在烘箱干燥后，精確稱重，與原棉球重量之差即為肉芽腫凈重，比較各組肉芽腫凈重。計算方式如下：

肉芽腫凈重=術(shù)后棉球凈重(g)-術(shù)前棉球凈重(g);

小鼠肉芽腫脹抑制率(%)=(模型組肉芽腫平均質(zhì)量-給藥組肉芽腫平均質(zhì)量)/模型組肉芽腫平均質(zhì)量×100%。

1.4.6 炎癥組織中PGE2含量的測定 取體重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，分組及給藥方法同“1.2.3”，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后30 min，對每只小鼠右足皮下進針于踝關(guān)節(jié)處注射0.1%角叉菜膠生理鹽水溶液 0.1 mL ，注射后 8 h時，于踝關(guān)節(jié)下將致炎足全部剪下，稱重，剝皮剪碎，生理鹽水漂洗2 min，以濾紙吸干水分，加入適量生理鹽水進行研磨，制備成勻漿液，以2500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液保存?zhèn)溆谩y定時，嚴格按照PGE2酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒使用說明進行操作，測定炎性組織中PGE2含量。

2 結(jié)果

2.1 對0.6%醋酸所致小鼠扭體實驗的影響 由表1可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組、給藥組低、中、高劑量均可明顯降低醋酸致小鼠扭體次數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 復方鵝絨藤凝膠膏劑對小鼠扭體反應的影響

2.2 對小鼠熱板致痛的影響 由表2可知，與給藥前痛閾值相比，消炎鎮(zhèn)痛膏組能顯著性提高小鼠的痛閾值(P<0.05)；復方鵝絨藤給藥組低、中、高劑量無顯著性差異；隨給藥劑量增加，給藥組小鼠舔足反應出現(xiàn)時間無明顯提高。

表2 復方鵝絨藤凝膠膏劑對熱板法致痛小鼠的影響

2.3 復方鵝絨藤凝膠膏劑對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 由表3可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組以及給藥組低、中、高劑量均能顯著性降低二甲苯所致小鼠耳腫脹度(P<0.05)。且隨藥物劑量增加，腫脹抑制率增加。

表3 復方鵝絨藤凝膠膏劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

2.4 對慢性肉芽腫的影響 由表4可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組以及復方鵝絨藤中、高劑量組均能顯著性抑制小鼠的肉芽腫生成(P<0. 05)；隨給藥劑量增加，腫脹抑制率增加。

表4 復方鵝絨藤凝膠膏劑對小鼠慢性肉芽腫的影響

2.5 對炎癥組織中PGE2含量的影響 由表5可知，與模型組比較，復方鵝絨藤凝膠膏劑低劑量組在抑制炎癥部位PGE2生成方面，差異無統(tǒng)計學意義，中、高劑量組與模型組比較，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，說明復方鵝絨藤凝膠膏劑能夠顯著抑制炎癥部位PGE2生成。

表5 復方鵝絨藤凝膠膏劑對炎癥組織中PGE2含量的影響

3 討 論

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對局部損傷的反應。前列腺素(PG)是花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下的代謝產(chǎn)物，PGE2是其中一個重要的炎癥介質(zhì)，其可以擴張血管、協(xié)同趨化因子的激活并通過增強血管壁通透性、大量吸引中性粒細胞從而引起發(fā)熱，并導致痛覺過敏從而引起炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展[4]。除此之外，炎癥發(fā)生時，大量氧自由基會伴隨PGE2的產(chǎn)生而產(chǎn)生，氧自由基通過誘發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而引起細胞損傷。

復方鵝絨藤來源于臨床經(jīng)驗方，已于臨床應用20多年，多以戟葉鵝絨藤等6味藥材混合研磨后制成普通膏劑，貼敷局部疼痛部位，以緩解如肩周炎和腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性病癥，療效受到肯定。但由于傳統(tǒng)貼膏釋藥性能較差，載藥不均勻，膏體易污染衣物等諸多缺點，使臨床用藥受到影響[5]。針對傳統(tǒng)貼膏的不足，本課題前期已將其改造成現(xiàn)代凝膠膏劑，工藝可行、可靠。本實驗采用四種經(jīng)典動物模型對復方鵝絨藤凝膠膏劑是否仍具有抗炎鎮(zhèn)痛作用進行研究。實驗中復方鵝絨藤凝膠膏劑對三種模型(小鼠扭體、二甲苯致小鼠耳腫脹及慢性肉芽腫)均表現(xiàn)出良好的藥用效果；而熱板實驗結(jié)果不顯著，原因可能是兩種致痛模型反映不同的作用機理，前者所模擬的為周圍神經(jīng)參與的炎癥性疼痛，而后者模擬的為高位中樞神經(jīng)參與的疼痛，說明復方鵝絨藤凝膠膏劑作為外用藥對中樞神經(jīng)的抑制作用較弱，而對周圍神經(jīng)參與的局部炎性疼痛有很好的抑制作用。通過對炎性足部中PGE2含量的測定，認為復方鵝絨藤凝膠膏劑的抗炎鎮(zhèn)痛與抑制炎癥部位PGE2的產(chǎn)生和釋放有關(guān)，但具體抗炎機制有待進一步研究。