張根生 楊慧鐸 岳曉霞 劉志鑫許春明

ZHANG Gen-sheng YANG Hui-duo YUE Xiao-xia LIU Zhi-xin XU Chun-ming

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin, Heilongjiang 150076, China)

隨著科技的發(fā)展，很多非傳統(tǒng)的植物油提取工藝受到關(guān)注[1]。水酶法作為一種新型提油方法，被廣泛地應(yīng)用在大豆、花生、油菜籽、松籽和玉米胚芽等多種油料作物的油提取上[2-4]。在使用水酶法提取南瓜籽油時(shí)，反應(yīng)溫度低，保持油的品質(zhì)同時(shí)又提高了蛋白質(zhì)利用率[5]。但是油提取率較低，只有小部分的油以游離油的形式存在，大部分的油是乳化狀態(tài)，存在于離心后的乳狀膏或乳狀液中。為了提高游離油提取率，乳狀液破乳至關(guān)重要。乳狀液是由蛋白質(zhì)、磷脂和碳水化合物等組成的穩(wěn)定狀態(tài)[6]。兩親性水溶性蛋白吸附在O/W型乳狀液界面上，形成一層具有立體屏障的硬質(zhì)膜，阻止油的釋放。Bos等[7]研究表明磷脂具有很高的表面活性，對乳狀液穩(wěn)定性影響顯著。而碳水化合物通過增加黏度或使水相凝膠[8-9]，來減少油體的聚集影響游離油的釋放，且效果隨其濃度的增加而增加[10]。

水酶法提取植物油中乳狀液的破乳方法有：物理破乳方法[11-13]、化學(xué)破乳方法[14]、生物酶法破乳及多種方法聯(lián)合使用[15-16]。其中生物酶法破乳通過水解乳狀液中的蛋白質(zhì)或表面磷脂來釋放油脂，實(shí)現(xiàn)破乳。朱敏敏等[17]對水酶法提取番茄籽油過程中乳狀液破乳進(jìn)行了研究，使用風(fēng)味蛋白酶破乳，出油率提高至51.57%。Wu等[18]采用蛋白酶對水酶法提取的大豆油乳狀液進(jìn)行破乳，游離油得率為88%。Chabrand等[19]在大豆乳狀液中添加溶血磷脂酶A1破乳，游離油提取率為95%。目前，對于水酶法提大豆油乳狀液酶法破乳研究較多，而對南瓜籽油破乳研究較少。王麗波等[20]進(jìn)行水酶法提取南瓜籽油研究，南瓜籽出油率為38.34%，提取率為85%左右，雖然提取率較高，但是在最后提取南瓜籽油時(shí)，直接在離心液中加入正已烷進(jìn)行萃取，使用有機(jī)試劑破乳，違背了水酶法提油綠色安全的初衷。本研究擬采用酶法對水酶法提南瓜籽油的乳狀液進(jìn)行破乳，同時(shí)對破乳后pH對乳狀液穩(wěn)定性的影響進(jìn)行分析，從而通過生物酶法聯(lián)合化學(xué)法提高破乳率，并且比較破乳前后油體平均粒徑大小分布，為提高水酶法提南瓜籽油的提取率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

南瓜籽：黑龍江賽美食品有限公司；

地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(酶活力6.0×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力5.0×105U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

磷脂酶(1.0×105U/g)：湖南世紀(jì)華星生物工程有限公司；

硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、無水乙醇、氨水、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9420A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：FW135型，天津市泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：DK-98-1型，天津市泰斯特儀器有限公司；

集熱式恒溫磁力攪拌器：CL-200型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

酸度計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

凱氏定氮儀：KDY-9820型，蘇州江東精密科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R205型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；

臺式高速離心機(jī)：TG16-WS型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

Zetasizer Nano粒度分析儀：ZEN3500型，英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳狀膏主要成分測定

(1) 水分含量的測定：按GB 5009.3—2016的直接干燥法執(zhí)行。

(2) 油脂含量的測定：按GB 5009.9—2016的堿水解法執(zhí)行。

(3) 蛋白質(zhì)含量的測定：按GB 5009.5—2016的凱氏定氮法執(zhí)行。

(4) 總灰分含量的測定：按GB 5009.4—2016執(zhí)行。

(5) 磷脂含量測定：按GB/T 5537—2008執(zhí)行。

1.2.2 乳狀膏制備工藝流程

南瓜籽仁→烘烤(105 ℃、1 h)→粉碎、過40目篩→浸泡1 h→磨漿→木瓜蛋白酶酶解(酶添加量4 500 U/g、酶解pH 7.5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h)→滅酶(80 ℃、10 min)→離心分離(3 600×g、20 min)→乳狀液→靜置12 h→取上層乳狀膏

1.2.3 酶法破乳工藝流程

乳狀膏加去離子水→攪拌→酶解→滅酶(80 ℃、10 min)→離心分離(3 600×g離心20 min)→游離油

1.2.4 酶的種類對破乳率的影響 取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g)，攪拌成均一的乳狀液后分別調(diào)節(jié)pH和溫度為各酶最適，依次添加2 000 U/g的地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、黃曲霉酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、磷脂酶進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為2 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。通過比較分析這5種酶對破乳率的影響。

1.2.5 酶法破乳工藝單因素試驗(yàn)

(1) 液料比對破乳率的影響：取一定質(zhì)量的乳狀膏，分別以0.5∶1.0，1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，2.5∶1.0 (mL/g)的液料比添加去離子水，攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5，添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃ 酶解2.0 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

(2) 酶添加量對破乳率的影響：取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g)，攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5，分別添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的量為1 000，2 000，3 000，4 000，5 000 U/g，50 ℃酶解2.0 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

(3) 酶解溫度對破乳率的影響：取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g)，攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5，添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g，分別在40，45，50，55，60 ℃酶解2.0 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

(4) 酶解pH對破乳率的影響：取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g)，攪拌成均一的乳狀液后分別調(diào)節(jié)pH至9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃酶解2.0 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

(5) 酶解時(shí)間對破乳率的影響：取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g)，攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5，添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃酶解時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，滅酶，冷卻至室溫后離心，抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

1.2.6 破乳率的測定

(1)

式中：

R——乳狀液的破乳率，%；

M1——破乳所得游離油質(zhì)量，g；

M2——乳狀液中含油質(zhì)量，g。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以酶法破乳單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，依據(jù)Box-Behnken的原理設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)，選液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解pH 4個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素做3個(gè)水平。以破乳率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0 作圖，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶法破乳工藝條件。

1.2.8 南瓜籽油滴粒徑分布和Zeta電位測定 在離心分離前，分別取一定質(zhì)量未破乳和經(jīng)優(yōu)化的酶法破乳的乳狀液，加去離子水配置成0.1 g/L的溶液，分別取1 mL放入可拋棄型聚苯乙烯樣品池。設(shè)置折射率(RI)1.47，吸收值0.001，使用粒度分析測定油滴粒徑。在離心分離前，取等質(zhì)量經(jīng)酶法破乳的乳狀液，分別調(diào)節(jié)不同pH(3，4，4.5，5，6，7，8，9)后配置成0.1 g/L的溶液，取樣注入彎曲式毛細(xì)管樣品池中，進(jìn)行Zeta電位測定。

2 結(jié)果分析

2.1 乳狀膏主要成分

乳狀膏主要成分測定結(jié)果見表1。由表1可知，乳狀膏中的水分、脂肪、蛋白質(zhì)含量較高。

2.2 酶種類的選擇

由圖1可知，在各酶最適條件和相同添加量的情況下進(jìn)行酶解反應(yīng)，地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶破乳率最高，破乳所得游離油最多，而磷脂酶破乳率低于大多數(shù)蛋白酶。因?yàn)槟竟系鞍酌该附馑频玫哪瞎献讶闋罡嘀械牡鞍踪|(zhì)被地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶水解形成小分子肽或氨基酸，使得由蛋白質(zhì)形成的膜所包圍的油脂釋放出來，得到游離油，實(shí)現(xiàn)破乳。雖然水解磷脂也是影響乳狀液穩(wěn)定性重要因素之一[19]，但是由表1可知，南瓜籽乳狀膏中磷脂含量偏低而蛋白質(zhì)含量較高，所以對于南瓜籽乳狀膏來說，蛋白酶更適合破乳，最后選擇地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶為反應(yīng)酶。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 酶法破乳工藝單因素試驗(yàn)

2.3.1 液料比對破乳率的影響 由圖2可知，液料比對破乳率影響顯著，隨著水相的增加破乳率也明顯升高，當(dāng)液料比為1∶1 (mL/g)時(shí)破乳率達(dá)到最高值為83%；繼續(xù)增大水相，破乳率逐漸下降。這是由于在乳狀液中添加少量的水，可以降低乳狀液的黏度同時(shí)增加液體的流動性[21]，增大酶與底物的接觸面積，使得酶解更加充分。但是過量添加水相會導(dǎo)致底物質(zhì)量濃度變小，酶濃度變低就不能充分地與底物反應(yīng)，破乳率會因此下降。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 酶添加量對破乳率的影響 由圖3可知，破乳率隨著酶添加量增加而逐漸變大，當(dāng)酶添加量為3 000 U/g時(shí)，破乳率達(dá)到最高值(85.18%)；繼續(xù)增加酶添加量時(shí)，破乳率緩慢下降并趨于平穩(wěn)。說明當(dāng)酶添加量逐漸增加至3 000 U/g 時(shí)，乳狀液中酶濃度增大，可以滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，大部分的蛋白質(zhì)被水解，脂多糖被分解，由大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的膜結(jié)構(gòu)被破壞，更多游離油被釋放出來，破乳率變大；而再繼續(xù)添加更多酶只會影響游離油的釋放，因?yàn)槲捶磻?yīng)的地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶附著在油體上或者其周圍，使得游離油不能被提取完全[22]。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 酶解溫度對破乳率的影響 由圖4可知，在地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的適宜反應(yīng)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，當(dāng)溫度在40～50 ℃時(shí)，破乳率隨著溫度的升高而迅速增大直至最高點(diǎn)，破乳率為最大值(85.08%)；當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)，破乳率緩慢下降直至平穩(wěn)。因?yàn)楫?dāng)溫度逐漸升高至50 ℃，溫度接近酶的最適反應(yīng)溫度，可更好地作用于底物；而當(dāng)溫度升至60 ℃時(shí)，小部分酶因?yàn)闇囟壬仙盍ο陆担瑢?dǎo)致破乳率小幅度下降。

2.3.4 酶解pH對破乳率的影響 由圖5可見，隨著酶解pH的增加，pH在9.5～10.5時(shí)，破乳率也明顯增大。當(dāng)pH增加至10.5～11.5時(shí)，破乳率下降。這可能是當(dāng)pH調(diào)節(jié)至11.5時(shí)，乳狀液中負(fù)電荷增多，蛋白質(zhì)和油滴形成了極穩(wěn)定狀態(tài)，對游離油的釋放造成阻礙。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.5 酶解時(shí)間對破乳率的影響 由圖6可知，隨著酶解時(shí)間的延長，破乳率緩慢上升了5.7%，當(dāng)酶解時(shí)間超過2.5 h時(shí)，破乳率迅速下降了12.7%。這可能是隨著時(shí)間的延長，酶與底物發(fā)生反應(yīng)，大量小油體聚集成大油滴，更多的游離油逐漸被釋放出來，破乳率升高；而當(dāng)時(shí)間超過2.5 h，酶解時(shí)間過長，由于蛋白質(zhì)乳化特性，部分大油滴變成乳化油，無法以游離油的形式釋放出來，導(dǎo)致破乳率大幅度下降[22]。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶法破乳工藝條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)酶法破乳的單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平設(shè)計(jì)見表2。以破乳率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見分別表2、3。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 通過Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對破乳率的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，建立破乳率對反應(yīng)溫度、液料比、酶添加量、pH的二次回歸模型如下：

R=88.42+0.13A-0.55B+0.23C-0.39D-0.37AB+0.34AC-0.46AD-0.64BC+1.48BD+0.12CD-0.88A2-3.03B2-2.28C2-2.59D2。

(2)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0對二次回歸方程模型進(jìn)行分析，破乳率的方差分析結(jié)果及其顯著性結(jié)果見表4。

由表4可知，模型的P<0.000 1，說明二次響應(yīng)面回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.265 4>0.05，這表示失擬項(xiàng)差異不顯著；決定系數(shù)R2=94.14%，說明模型能夠解釋94.14%的響應(yīng)值變化。根據(jù)以上各值可以判斷出，該模型與試驗(yàn)擬合度較高，試驗(yàn)誤差小，可信度較高，可以很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)酶法破乳工藝條件的優(yōu)化。由各因素的F值可以得到4個(gè)因素對破乳率影響大小順序?yàn)椋築(液料比)>D(pH)>C(酶添加量)>A(酶解溫度)。

2.4.3 交互作用分析 由表4及圖7可知，BD的P<0.000 1，B和D交互作用對破乳率影響極顯著，破乳率隨著B與D水平的增加而升高；BC的P<0.05，說明B和C交互作用對破乳率影響顯著，破乳率隨著液料比和酶添加量交互作用的增加先增加后下降；隨著A和D交互水平增加，破乳率變化比較平緩，與前2個(gè)交互作用相比較，此交互作用對破乳率影響不顯著。

2.4.4 酶法破乳最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳酶法破乳工藝為：液料比0.9∶1.0 (mL/g)、酶添加量3 078 U/g、酶解pH 10.4、溫度51 ℃。由響應(yīng)面法得出此條件下酶法破乳的破乳率理論值為88.50%。為了驗(yàn)證該試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，將最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次取平均值。最后測得破乳率為88.39%，與響應(yīng)面預(yù)測所得的理論值相比，相對誤差為0.12%，此結(jié)果表明經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的條件可以更好地預(yù)測酶法破乳工藝。

2.5 破乳前后油滴粒徑分布及pH對乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.5.1 破乳前后的油滴粒徑分布 由圖8可知，酶法破乳前油滴的平均粒徑為2.950 μm，破乳后平均粒徑增加至48.000 μm，粒徑明顯增大。這是因?yàn)槠迫榍坝腕w被蛋白質(zhì)所形成的膜包裹著，以較小的油滴形式不均勻地分布在乳狀液中，經(jīng)過酶法破乳后，蛋白質(zhì)膜被水解破壞，油體被釋放出來聚集成更大的油滴。比較破乳前后油滴平均粒徑大小，更加直觀地表達(dá)了破乳的重要性。

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型119.1414.008.5133.13<0.000 1**A0.191.000.190.740.404 2B3.641.003.6414.170.002 1**C0.651.000.652.530.134 3D1.851.001.857.200.017 8*AB0.531.000.532.070.171 8AC0.461.000.461.800.201 0AD0.861.000.863.330.089 4BC1.661.001.666.480.023 3*BD8.731.008.7333.99<0.000 1**CD0.061.000.060.230.636 3A24.991.004.9919.440.000 6**B259.651.0059.65232.23<0.000 1**C233.651.0033.65130.99<0.000 1**D243.511.0043.51169.40<0.000 1**殘差3.6014.000.26失擬項(xiàng)2.9910.000.301.990.265 4凈誤差0.604.000.15總和122.7328.00

圖8 粒徑分布

2.5.2 不同pH下乳狀液的Zeta電位 由圖9可知，Zeta電位值隨著pH增加而降低。當(dāng)pH在 4.25～4.50時(shí)，pH接近南瓜籽蛋白的等電點(diǎn)，Zeta電位值接近于0，此時(shí)蛋白質(zhì)溶解性最差乳化力最小，吸附在油滴和水之間的蛋白最少，由于不存在靜電排斥作用，油滴易聚集在一起，乳狀液處于極不穩(wěn)定的狀態(tài)[23]；當(dāng)pH在8～9時(shí)，Zeta電位值<-37.3 mV，乳狀液負(fù)電荷增多，蛋白質(zhì)帶相同電荷相斥，由蛋白質(zhì)膜所包裹的油滴不易上浮聚集在一起，乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)[24]。這也證明為了酶法破乳后酸化處理的意義，酶法處理后乳狀液pH值在8～9時(shí)，乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)，為了再次提高破乳率，調(diào)節(jié)pH為4.25～4.50時(shí)接近南瓜籽蛋白等電點(diǎn)，使乳狀液處于極不穩(wěn)定狀態(tài)，游離油釋放的更充分。為方便工業(yè)化生產(chǎn)，調(diào)節(jié)pH至4.5，使破乳率提高至95.47%。

圖9 pH對乳狀液Zeta電位的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選用地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶，酶解由水酶法提取南瓜籽油過程中產(chǎn)生的乳狀液，實(shí)現(xiàn)破乳提高南瓜籽油的提取率。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)，得出酶法破乳的最佳工藝為液料比0.9∶1.0 (mL/g)、添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶3 078 U/g、調(diào)節(jié)pH 10.4、酶解溫度51 ℃、酶解時(shí)間2.5 h，驗(yàn)證所得破乳率為88.39%。同時(shí)還研究了pH對乳狀液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)在酶法破乳后進(jìn)行酸化處理，通過調(diào)節(jié)pH至4.5，破乳率可達(dá)到95.47%。通過比較破乳前后油體粒徑分布的變化趨勢，更加確定了本試驗(yàn)所研究的破乳方法的優(yōu)勢，為水酶法提取南瓜籽油的破乳工藝條件提供了可靠的理論依據(jù)。但本試驗(yàn)只適用于水酶法提取南瓜籽油的破乳研究，有局限性，還需更深入地研究各種油料作物水酶法提取的破乳工藝。