張靜 查文清 陳小鴻 蔣莉 蔣一雄

【摘要】 目的：探討青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞的增殖和Fascin表達(dá)的影響。方法：選用786-0腎癌細(xì)胞株，分別通過不同濃度的青蒿素作用細(xì)胞株，收集不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 h）的細(xì)胞，運(yùn)用細(xì)胞增殖CCK-8法測定青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞的增殖；通過Western Blot檢測青蒿素干預(yù)后腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞Fascin的表達(dá)。結(jié)果：隨著藥物濃度的增加，青蒿素可明顯抑制腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞的增殖（P<0.01），青蒿素可顯著降低腎癌細(xì)胞株786-0 Fascin蛋白的表達(dá)（P<0.05）。

結(jié)論：青蒿素通過抑制腎癌細(xì)胞增殖和Fascin蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增生。

【關(guān)鍵詞】 腎癌； 青蒿素； 腎癌細(xì)胞株786-0； 增殖； Fascin

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Artemisinin on the proliferation and Fascin expression of human renal cell carcinoma cell line 786-0.Method：786-0 cell line were cultured in vitro and treated with different doses Artemisinin.The cells were collected at different time points（0，24，48，72 h）.CCK-8 method was used to detect the cell proliferation，the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0 cells were analyzed by Western Blot.Result：Different doses artemisinin could significantly inhibit the proliferation of renal cell carcinoma cell line 786-0 with the increase of drug concentration （P<0.01），Artemisinin could obviously reduced the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0（P<0.05）.Conclusion：Artemisinin might inhibit the proliferation and the expression of Fascin，then inhibit the malignant proliferation of tumor cells.

【Key words】 Renal cell carcinoma； Artemisinin； Human renal cell carcinoma cell line 786-0； Proliferation； Fascin

First-authors address：Nanshan District Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.008

腎癌又稱腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是指起源于腎皮質(zhì)的具有異質(zhì)性的腫瘤[1]。腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)，腎癌起病隱匿，多發(fā)現(xiàn)較晚。目前，膀胱癌各種預(yù)防和治療的藥物均不理想或毒副作用較大。研究發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其異常表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲及預(yù)后等生物學(xué)行為相關(guān)[2]。青蒿素是一類傳統(tǒng)的抗瘧藥，隨著臨床試驗(yàn)的深入研究，其抗腫瘤作用備受關(guān)注，而在腎癌方面的研究國內(nèi)外卻報(bào)道甚少[3]。本實(shí)驗(yàn)以人腎癌細(xì)胞株786-0作為研究對(duì)象，應(yīng)用CCK-8法和Western Blot等技術(shù)觀察青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑 材料：腎癌細(xì)胞株786-0（購買于上海中科院細(xì)胞庫）。儀器和試劑：多功能讀板機(jī)（Beckman PRADIGM）、蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、電子天平（Satorius公司）、小型離心機(jī)（Eppendorf公司）、倒置相差顯微鏡（日本索尼公司）、Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、Facsin Monocional Antibody（美國Millipor公司）、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）、RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胰蛋白酶（Hyclon公司）、青蒿素、胎牛血清（Hyclon公司）、磷酸緩沖液（PBS）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、二甲亞砜（DMSO）[4]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，5% CO2和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至密度為60%～80%時(shí)傳代，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

1.3 藥物處理 將青蒿素溶于DMSO，再用細(xì)胞完全工作液配制成200、100、50、25 mg/L四個(gè)不同濃度的工作液。

1.4 CCK8法測定細(xì)胞增殖 在96孔板中取24個(gè)孔（取板中間孔，周圍一圈棄置，加培養(yǎng)基防蒸發(fā)），做好相應(yīng)標(biāo)記，取4個(gè)孔加培養(yǎng)基作為空白組，其余20孔中均加入100μL的細(xì)胞懸液（細(xì)胞計(jì)數(shù)2×103個(gè)/孔）。將培養(yǎng)板在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將孔中培養(yǎng)基吸出，向每孔加入100 μL待測藥物，各濃度均設(shè)4個(gè)附孔。培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定其吸光度。記錄結(jié)果，以青蒿素濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞抑制率（%）=（對(duì)照組吸光度-青蒿素藥物組吸光度值）/對(duì)照組吸光度×100%[6-8]。

1.5 Western Blot檢測Fascin的表達(dá) RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%的脫脂奶粉中封閉90 min，加一抗（Fascin 1.25∶1 000，β-actin 1∶1 000）4 ℃過夜；洗膜后加入1∶1 000的二抗稀釋液室溫下孵育1 h。ECL顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[9]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞的增殖 不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞作用48 h后，在450 nm處其吸光度分別為（2.17±0.04）、（1.62±0.13）、（1.21±0.09）、（0.83±0.14）、（0.61±0.12）。依據(jù)抑制率（%）=（對(duì)照組吸光度-藥物組吸光度值）/對(duì)照組吸光度×100%。不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞作用48 h后，其抑制率分別為0、（27.0±2.2）、（48.0±3.6）、（64.0±4.8）、（73.0±2.1）%，見圖1，各濃度間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Western Blot檢測不同濃度青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0 Fascin蛋白的表達(dá) 以GAPDH作為蛋白定量內(nèi)參，運(yùn)用Image J分析Fascin蛋白表達(dá)的灰度值，不同濃度的青蒿素（0、25、50、100、200 mg/L）分別干預(yù)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞作用48 h后，F(xiàn)ascin蛋白的灰度值分別為（158.0±10.2）、（120.0±7.5）、（82.0±11.4）、（41.0±4.8）、（33.0±6.2），與0 mg/L青蒿素比較，青蒿素藥物組干預(yù)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞后的Fascin蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

腎癌患者往往對(duì)放療和化療耐受，其治療效果不理想，青蒿素及其衍生物是一類高效、速效、低毒的抗瘧藥物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物除了具有抗瘧作用外，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有選擇性抑制和/或殺傷作用[10-11]。本研究選擇腎癌細(xì)胞株786-0為研究對(duì)象，體外觀察青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0的增殖和Fascin蛋白表達(dá)的影響。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)，腫瘤藥物可以通過多種方式抑制腫瘤細(xì)胞的生長，如調(diào)控周期、凋亡和壞死等。研究表明，青蒿素對(duì)腫瘤的殺傷主要是通過調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)[12-14]。筆者通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞作用48 h后，明顯能夠抑制腎癌細(xì)胞株786-0的生長，并隨著濃度的增加，其抑制作用呈逐漸增強(qiáng)趨勢，即說明青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0體外抑制作用明顯，可以明顯抑制腎癌細(xì)胞株786-0的增殖，從而達(dá)到腫瘤抑制的目的。研究報(bào)道腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞過度增殖的結(jié)果，無論體外或體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)都已證明，青蒿素對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用[15]。國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)對(duì)青蒿素對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病變細(xì)胞株的生長抑制作用，從而進(jìn)一步證實(shí)了青蒿素通過抑制腫瘤細(xì)胞過度增殖作用途徑實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用[16-17]。

Fascin是一種分子量為55 kD的骨架蛋白，主要是和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，早期研究發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在一些惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，駱曼等[18]報(bào)道Fascin蛋白在腎細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)并和腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，并證實(shí)Fascin可以作為腎癌一個(gè)分子標(biāo)志物，用于惡性腫瘤的診斷和鑒別，同時(shí)胡娜等[19]發(fā)現(xiàn)，沉默腎癌細(xì)胞中的Fascin表達(dá)后，細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯減弱。而本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin蛋白也在腎癌細(xì)胞株786-0中高表達(dá)，應(yīng)用不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞作用48 h后，青蒿素能夠明顯抑制Fascin蛋白在腎癌細(xì)胞株786-0的表達(dá)，即說明青蒿素可以通過抑制Fascin蛋白在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腎癌的發(fā)生發(fā)展[20]。

綜上所述，蒿素作為一種毒副作用較少的中藥成分，一定程度上能抑制膀胱癌RT4細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其死亡，有可能成為一種新型輔助化療藥物。青蒿素在體外能夠明顯抑制腎癌細(xì)胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表達(dá)，至于青蒿素的確切作用機(jī)制和在體內(nèi)抗腎癌作用尚需進(jìn)一步探討。

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