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魯氏酵母用于發(fā)酵香腸中發(fā)酵生產(chǎn)性能及安全性能研究

2018-12-13 06:15高紹金李志江趙家圓韓齊李艷青
中國調(diào)味品 2018年12期
關鍵詞:發(fā)酵劑香腸酵母菌

高紹金,李志江,趙家圓,韓齊,李艷青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院,黑龍江 大慶 163319)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)是傳統(tǒng)豆醬、醬油生產(chǎn)過程中能夠產(chǎn)生風味的微生物,耐鹽性強;產(chǎn)醇類、糖醇類及呋喃酮類風味物質(zhì),并與乳酸曲的代謝產(chǎn)物發(fā)生反應[1],利于香氣的形成;能將谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)化為底物生成谷氨酸,增強鮮味,對發(fā)酵后熟階段中香氣成分的產(chǎn)生具有至關重要的作用[2]。

發(fā)酵香腸是指以碎肉、脂質(zhì)為主要原料,與鹽、糖、味精、香料及微生物發(fā)酵劑等混合腌制后灌進腸衣,在一定條件下發(fā)酵而成的發(fā)酵肉制品[3-6]。發(fā)酵香腸中常用的發(fā)酵劑菌株是乳酸菌、接觸酶陰性球菌(主要是葡萄球菌屬和考克斯菌屬)以及酵母和霉菌[7]。發(fā)酵香腸不僅風味特殊,食用方便,還含有多種有益于人體的營養(yǎng)成分,自20世紀以來,國內(nèi)對發(fā)酵香腸的研究便備受矚目,發(fā)酵劑種類日益更新,由單一的微生物發(fā)酵劑到復合發(fā)酵劑[8]。復配發(fā)酵劑是直投式發(fā)酵劑的一種,通過優(yōu)勢菌的作用,在不改變發(fā)酵品質(zhì)的基礎上,成功克服了微生物發(fā)酵劑的不足,從而改善了發(fā)酵劑的性能[9,10]。

雖然各種發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵香腸中已有廣泛的應用,但鮮有將魯氏酵母加入發(fā)酵香腸中,并研究其對發(fā)酵香腸中品質(zhì)影響的相關報道。因此,將魯氏酵母菌加入發(fā)酵香腸中,探究其是否能夠提高發(fā)酵香腸的風味,是否具有增鮮增香的作用,將對魯氏酵母的開發(fā)提供良好的基礎,為生產(chǎn)新型發(fā)酵食品提供依據(jù)。本研究通過菌種的耐酸性、耐食鹽能力、耐亞硝酸鹽能力、生長溫度和最適生長溫度等試驗,對其發(fā)酵生產(chǎn)性能進行測定,同時,通過吲哚試驗、溶血試驗及藥敏試驗,確定菌種的安全性能。判斷其是否符合應用于發(fā)酵肉制品的要求,以便生產(chǎn)出新型發(fā)酵肉制品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料

YPD液體培養(yǎng)基、血瓊脂平板、蛋白胨水培養(yǎng)基、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒、藥敏紙片(諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素)、氯化鈉(NaCl)、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、亞硝酸鈉(NaNO2)等常規(guī)化學試劑,均購于大慶市博微生物試劑有限公司。

1.1.2 菌種來源

魯氏酵母菌(編號:32899):中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌:均為黑龍江八一農(nóng)墾大學微生物實驗室分離純化菌種。

1.1.3 儀器設備

MET-TLERAE 100型分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器公司; SW-CJ-1 FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;THZ-82 A型水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;HZQ-QX型全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 魯氏酵母的活化及培養(yǎng)

挑取魯氏酵母凍干粉進行活化,將100 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基在無菌工作臺中倒入菌粉,放入全溫振蕩器中,28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng),培養(yǎng)3天。將5 mL已活化的菌液加入100 mL培養(yǎng)基中,放入全溫振蕩培養(yǎng)箱中,28 ℃、180 r/min,培養(yǎng)30 h。

1.2.2 魯氏酵母的發(fā)酵生產(chǎn)性能研究

1.2.2.1 不同酸度對魯氏酵母菌生長的影響

利用比濁法的原理,用光密度值(OD值)的變化來判斷菌株存活情況。根據(jù)朗伯比爾定律OD=logItIO=kbc,c表示樣品濃度,若樣品液厚度b一定,則OD值與樣品的濁度相關[11]。將活化好的菌種菌液以1%的接種比例,分別加入用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)pH值(3,4,5,6,7)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后,將菌液稀釋至合適倍數(shù)(使吸光值在0.1~0.8之間),在波長600 nm處測量吸光度值,每組試驗做3組平行。

1.2.2.2 不同食鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響

將活化好的菌種菌液以1%的接種比例,加入不同鹽濃度(0,2%,4%,6%,8%,10%)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后,測吸光度值,做3組平行試驗。

1.2.2.3 不同亞硝酸鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響

將活化好的菌種菌液以1%的接種比例,加入不同NaNO2濃度(0,50,100,150,200 mg/kg)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后,于波長600 nm處測量吸光度值,做3組平行試驗。

1.2.2.4 不同溫度對魯氏酵母菌生長的影響

將活化好的酵母菌懸液按一定量接種至YPD液體培養(yǎng)基中,置于25,28,30,35,40 ℃,于180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后,于波長600 nm處測量吸光度值,做3組平行試驗。

1.2.3 魯氏酵母的安全性研究

1.2.3.1 吲哚試驗

將3%活化好的魯氏酵母菌株接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中,在28 ℃培養(yǎng)72 h,滴入吲哚3~4滴試劑,觀察試驗結(jié)果。同時用大腸桿菌做陽性對照,并做空白試驗。

1.2.3.2 溶血試驗

將活化好的魯氏酵母菌株用接菌環(huán)劃線和穿刺于血瓊脂平板中,28 ℃培養(yǎng)48 h,觀察有無溶血圈出現(xiàn)。同時用金黃色葡萄球菌做陽性對照,并做空白試驗。

1.2.3.3 藥敏試驗

分別吸取1 mL(約1×108cfu/mL)供試菌株菌液于15 mL YPD固體培養(yǎng)基(50 ℃)中,混勻后傾倒至滅菌培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基凝固后,用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面。室溫放置1 h,然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),24 h后測量并記錄抑菌圈直徑,每種抗生素做3組平行。分離菌株敏感性參照CLSI的最新版本標準進行判定[12]。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Statistix 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,利用SigmaPlot 12.5進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏酵母菌生長曲線

微生物的生長曲線代表該微生物在新的環(huán)境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動態(tài)變化,一般分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段。魯氏酵母菌生長的標準曲線見圖1。

圖1 魯氏酵母生長標準曲線Fig.1 Growth curve of Zygosaccharomyces rouxii

由圖1可知,在剛接種魯氏酵母時,測其吸光度值為0,說明此時魯氏酵母還未生長;在培養(yǎng)時間為0~48 h時,隨著培養(yǎng)時間的增加,測得的魯氏酵母的吸光度值越來越大,直到培養(yǎng)48 h時吸光度值最大;在培養(yǎng)36~72 h時,吸光度值在0.6~0.9,而此時的生長曲線呈對數(shù)增長,說明魯氏酵母菌在此時生長最旺盛。

2.2 魯氏酵母的發(fā)酵生產(chǎn)性能研究

2.2.1 不同酸度對魯氏酵母菌生長的影響

酵母菌通常與乳酸菌復配成復合發(fā)酵劑應用于發(fā)酵肉制品中,因此酵母菌必須適應乳酸菌所造成的酸性環(huán)境[13]。在發(fā)酵過程中,pH在4.8~5.0時對致病菌及腐敗菌的抑制效果最好,可加快發(fā)酵香腸色澤、風味的形成,減少蛋白質(zhì)的束水能力以保證干燥,因此,需測定魯氏酵母在不同pH下的生長情況。

圖2 不同酸度對魯氏酵母菌生長的影響Fig.2 Effect of different acidity on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖2可知,魯氏酵母菌在pH為3時仍能較好存活;在pH為4~6的酸性環(huán)境中生長良好,在此期間,隨著pH的增加,生長越來越旺盛。故而說明魯氏酵母菌能夠在酸性環(huán)境下穩(wěn)定生長,符合作為發(fā)酵劑的標準。

2.2.2 不同食鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響

相關資料顯示,腌制發(fā)酵香腸時,通常添加2%左右的食鹽,但隨著發(fā)酵過程的進行,香腸內(nèi)部水分含量會逐漸減少,食鹽濃度會逐步升高,在一般的發(fā)酵香腸中,食鹽含量可達到5%。因此,欲將魯氏酵母菌作為發(fā)酵劑應用于發(fā)酵香腸中,必將考慮其對食鹽的耐受能力,本試驗測定魯氏酵母菌的最大食鹽耐受濃度為6%。

圖3 不同食鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of different salt concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖3可知,添加食鹽濃度對魯氏酵母菌的生長影響較大,食鹽濃度越高,抑制越明顯。在食鹽濃度為2%時,魯氏酵母的生長未發(fā)生明顯變化;當食鹽濃度為4%~6%時,吸光度值有緩慢降低趨勢,但仍處于良好狀態(tài);食鹽濃度達到8%時,吸光度值下降明顯,魯氏酵母菌的生長趨于緩慢。因此,魯氏酵母菌能夠耐受6%的食鹽濃度,就此項指標而言,其可作為發(fā)酵劑使用。

2.2.3 不同亞硝酸鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響

亞硝酸鹽作為重要的食品添加劑,對發(fā)酵香腸的生產(chǎn)有著密不可分的作用。在香腸的發(fā)酵過程中,利于顏色和腌臘制品特殊風味和質(zhì)構的產(chǎn)生;對于在肉制品中危害較大的致病菌有顯著抑制其生長繁殖的作用[14-17],確保產(chǎn)品的生物安全性。對于食品中亞硝酸鹽的添加量我國有著嚴格的規(guī)定,不得超過30 mg/kg;而用來生產(chǎn)肉品發(fā)酵劑的微生物一般要求可耐受100 mg/kg的亞硝酸鹽濃度,因此本試驗測定的最大亞硝酸鹽濃度為200 mg/kg。

圖4 不同亞硝酸鹽濃度對魯氏酵母菌生長的影響Fig.4 Effect of different nitrite concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖4可知,隨著亞硝酸鹽濃度的增加,魯氏酵母菌的生長受到不同程度的抑制。當亞硝酸鹽濃度為0.005%時,魯氏酵母菌的吸光度值驟然下降,生長速度明顯遲緩;亞硝酸鹽濃度達到0.015%時,魯氏酵母菌仍保持一定程度的生長;當亞硝酸鹽濃度升高至0.020%時,吸光度值明顯小于0.6,處于生長滯緩階段。由此說明,魯氏酵母菌具有較高的耐受亞硝酸鹽能力,可作為發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑使用。

2.2.4 不同溫度對魯氏酵母菌生長的影響

發(fā)酵香腸的發(fā)酵溫度通常為25~28 ℃,為了保證作為發(fā)酵劑的酵母菌能夠在生產(chǎn)條件下良好生長,菌株的最佳生長溫度須符合此溫度范圍。

圖5 不同溫度對魯氏酵母菌生長的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖5可知,魯氏酵母菌在25 ℃時生長處于旺盛階段;在28 ℃時生長最旺盛,此后隨溫度升高,吸光度值降低,生長緩慢,35 ℃時生長遲緩,由此可見,魯氏酵母菌在25~32 ℃之間生長旺盛,最適生長溫度為28 ℃,符合作為發(fā)酵劑的要求。

2.3 魯氏酵母的安全性研究

2.3.1 吲哚試驗

吲哚試驗能夠檢測菌株能否分解到蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一,可以參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成,調(diào)節(jié)免疫功能,具有促進消化吸收的作用[18]。如果待測菌株吲哚試驗呈陽性,則說明該菌株能分解色氨酸,從而引起人體代謝障礙。

圖6 魯氏酵母菌吲哚試驗結(jié)果Fig.6 Results of indole test of Zygosaccharomyces rouxii

注:1為未添加菌種;2~4為添加魯氏酵母;5為添加大腸桿菌。

向培養(yǎng)好的菌液中滴加指示劑后,空白對照組與魯氏酵母菌的3組平行試驗均未出現(xiàn)紅色圓環(huán),而大腸桿菌中出現(xiàn)紅色圓環(huán),由圖6可知,魯氏酵母菌的吲哚試驗結(jié)果呈陰性,大腸桿菌的吲哚試驗結(jié)果呈陽性。吲哚試驗結(jié)果表明,魯氏酵母菌不會分解色氨酸產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)。

2.3.2 溶血試驗

溶血是指紅細胞破裂溶解現(xiàn)象,可由多種理化因素和毒素引起[19]。如果發(fā)酵食品所用微生物具有溶血現(xiàn)象,會對人體造成一定危害,因此有必要在使用前對其進行溶血試驗。

圖7 魯氏酵母菌溶血試驗結(jié)果Fig.7 The results of hemolytic test of Zygosaccharomyces rouxii

注:1為未接種菌種;2~4為接種魯氏酵母菌;5左側(cè)為接種魯氏酵母菌,右側(cè)為接種金黃色葡萄球菌。

由圖7可知,在培養(yǎng)的魯氏酵母菌周圍的瓊脂未顯示綠色,同時并未出現(xiàn)透明圈,說明沒有產(chǎn)生α-溶血和β-溶血現(xiàn)象,而金黃色葡萄球菌周圍則顯示透明溶血圈;實驗結(jié)果說明,本試驗所用的魯氏酵母菌無溶血現(xiàn)象發(fā)生,說明菌株不是溶血細菌,具有食用安全性。

2.3.3 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法測定了魯氏酵母菌對7種抗生素的抗藥性情況,測定結(jié)果見表1。菌株對抗生素產(chǎn)生的抑菌圈直徑均在質(zhì)控范圍內(nèi),因此,試驗測得的數(shù)據(jù)為真實結(jié)果。

表1 魯氏酵母菌的抑菌圈直徑及抗性結(jié)果Table 1 Diameter of bacteriostatic circle and antibiotic resistance results of Zygosaccharomyces rouxii

注:抑菌圈直徑以平均值±標準差的形式表示;供試菌株對某種抗生素敏感(susceptible)用S表示,中度敏感(intermediate)用I表示,抗性(resistant)用R表示。

由表1可知,魯氏酵母菌對紅霉素(大環(huán)內(nèi)酯類藥物)、氨芐西林(青霉素類藥物)、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星(喹諾酮類藥物)以及鏈霉素(氨基糖苷類藥物)敏感,對阿莫西林有抗性,說明魯氏酵母可安全用于肉品發(fā)酵劑。

3 結(jié)論

目前,國內(nèi)外關于發(fā)酵肉制品的研究始終都是熱門,關于各種微生物菌群的開發(fā)及綜合使用等相關研究更是層出不窮。國內(nèi)的眾多研究者研究微生物發(fā)酵劑時,大多關注于細菌的相關研究,如乳酸菌、微球菌、葡萄球菌等,也有些研究者將具有改善發(fā)酵肉制品風味及促進顏色等作用的酵母菌定為研究方向,將其配合乳酸菌等微生物作為發(fā)酵劑使用。

本研究通過菌種的耐酸性、耐食鹽能力、耐亞硝酸鹽能力、生長溫度和最適生長溫度等試驗,對其發(fā)酵生產(chǎn)性能進行測定,同時,通過吲哚試驗、溶血試驗及藥敏試驗,確定菌種的安全性能,判斷其是否符合應用于發(fā)酵肉制品的要求。試驗結(jié)果顯示,魯氏酵母菌在pH為4~6的培養(yǎng)條件下可良好生長;耐受6%的食鹽濃度和150 mg/kg的亞硝酸鹽;在25~32 ℃均能較好生長,在28 ℃生長情況最佳;在培養(yǎng)過程中,魯氏酵母菌不會產(chǎn)生吲哚類物質(zhì),亦不屬于溶血細菌;對紅霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星以及鏈霉素敏感,對阿莫西林有抗性。綜上所述,魯氏酵母菌的各項生產(chǎn)安全性能符合作為發(fā)酵肉制品的要求,可考慮與乳酸菌復配成復合發(fā)酵劑應用于發(fā)酵香腸或其他發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn),起到穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)品品質(zhì)的作用。

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