洪澄英，陳懷生，曹靜，杜玉洛，劉雪燕，李威

（暨南大學附屬第二臨床醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 深圳 518020）

膿毒癥是嚴重感染所導致的全身炎癥反應綜合征［1］，病情發(fā)展常可引起多臟器功能衰竭，病死率達20%～30%［2］。研究顯示約60%膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全［3-4］，而合并心功能不全患者病死率高［5］。目前研究［6］認為，心肌線粒體功能損傷是膿毒癥患者心功能不全的主要原因之一，修復心肌線粒體功能可能對膿毒癥心功能不全有一定緩解作用。有研究［7］表明β受體拮抗劑有助于改善膿毒癥所致的心肌損害。評估β受體拮抗劑治療膿毒癥患者的療效和安全性的研究表明β受體拮抗劑不增加死亡風險［8］，并有可能有益于患者的預后［9］。動物實驗［10］也表明β受體拮抗劑可以抑制膿毒癥模型大鼠心肌細胞凋亡、改善血流動力學參數(shù)。本研究探討β受體拮抗劑對膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠模型建立和分組

SD雄性大鼠20只，體質量250～350 g，購自國家動物實驗種子中心上海分中心暨上海斯萊克實驗動物責任有限公司。實驗進行前 20～25 ℃和60%濕度條件下12 h光照/12 h黑暗交替，適應性飼養(yǎng)1周。然后按照簡單隨機數(shù)字法分為4組，每組5只，分別為對照組、模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組。對照組大鼠不做處理。其余3組參考文獻［11］采用小劑量內毒素持續(xù)注射誘導建立膿毒癥模型：根據(jù)大鼠體質量準備內毒素（ 10 mg/kg） ，加生理鹽水溶解為10 mL，經(jīng)大鼠尾部靜脈注射［0.42 mL/（ kg·h） ］并持續(xù)24 h。建模成功后美托洛爾組經(jīng)尾注射美托洛爾0.05 mg（ 沖擊量） ，然后持續(xù)注射美托洛爾［0.2 mg/（ kg·h） ］［12］；艾司洛爾組經(jīng)尾注射艾司洛爾［15 mg/（ kg·h） ］［13］；模型組注射等量的生理鹽水。各組均持續(xù)治療48 h。

1.2 檢測指標

（1） 模型成功驗證：記錄各組大鼠精神狀態(tài)、生活習慣、體溫，眼眶靜脈取血檢測白細胞 （white blood cell，WBC）數(shù) （血常規(guī)分析儀） ，腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6） 水平 （ELISA） 。 （2） 治療前 （0 h） 、治療24 h和48 h后檢測各組大鼠心率、平均動脈血壓； （3） 治療48 h后，處死大鼠，取心肌組織切片行病理學檢測 （HE染色，電子顯微鏡下觀察各組線粒體）； （4） 治療48 h后，采用qPCR和Western blotting分別檢測各組線粒體內膜特異的腺甘酸轉移酶 （adenosine transferase，ANT） mRNA和蛋白表達水平。

1.2.1 ELISA檢測：眼眶靜脈取血 （0.3 mL） ，采用離心機3 000 r/min 4 ℃離心10 min，然后-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒 （美國R&D公司） 檢測各組血清中TNF-α、IL-6表達水平，所有操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.2 qPCR檢測：將大鼠心肌組織在液氮中迅速磨碎，加入1 mL Trizol溶液，上下顛倒混勻，室溫放置10 min使組織充分裂解；加入0.2 mL氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5 min，溶液分成上下兩層；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；小心吸取上層清液（ 約0.6 mL） 到新的離心管中；加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻后室溫放置5 min，觀察白色沉淀析出；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，收集RNA沉淀；加入1 mL 75%乙醇（ DEPC水稀釋） 洗滌RNA，7 500 r/min離心5 min（ 4 ℃）；棄去乙醇，吹干后加入20～100 μ L的RNase-free或高溫滅菌的DEPC水溶解；取1 μ L樣品測定樣品濃度以及純度，260/280在1.8～2.0之間，260/230在2.0～3.0之間為佳；取約100 ng RNA用于瓊脂糖膠電泳，檢測其是否降解；RNA樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?。去除DNA雜質，在RNase-free或DEPC處理過的200 μ L離心管中，配制如下反應體系，95 ℃處理3 min或70 ℃處理15 min，使RNA聚合酶失活，合成獲得cDNA第一鏈。分別制作上游引物（5’-GTATCTGTCATCAAAGAAGGCTG-3’） 和下游引物（ 3’-CTACCATCGGTTGTCAGACTT-5’） ，采用PCR檢測儀進行定量擴增，并定量檢測各指標。RT-PCR擴增程序為：42 ℃ 預處理5 min； 94 ℃度熱變性10 s； 94 ℃熱處理 5 s，60 ℃延伸35 s，循環(huán)40次； 72 ℃5 min。以β-actin為內參，利用定量PCR儀自帶軟件算法2-ΔΔCt獲得各指標的相對表達量。

1.2.3 Western blotting檢測：心肌勻漿收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，測定蛋白濃度，按50 μ g/mL蛋白含量配制上樣蛋白樣品。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜 （NC膜） 上，5%脫脂牛奶封閉蛋白，依次孵育一抗、二抗，Bradford法進行組織勻漿的蛋白定量，以GAPDH為內參照，比較ANT蛋白表達情況。最后用底物發(fā)光法進行顯色，膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.01進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用x-±s表示。組間比較采用t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠模型建立

內霉素建模后，模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡不振、豎毛、嗜睡、眼鼻滲血、稀便等膿毒癥癥狀，而對照組未有上述癥狀。與對照組比較，模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組體溫和和WBC顯著降低 （均P ＜ 0.001） ，而血清TNF-α及IL-6表達水平都顯著升高 （均P ＜ 0.05） ，表明膿毒癥模型建立成功。見表1。

2.2 各組大鼠治療前 （0 h） 、治療24、48 h 后心率和平均動脈壓比較

表1 建模后各組體溫、白細胞、血清TNF-α及IL-6表達水平比較Tab.1 Body temperature，white blood cell count，and serum TNF-α and IL-6 expression in the four groups after modeling

結果顯示，治療前美托洛爾組、艾司洛爾組與模型組比較心率和平均動脈壓沒有統(tǒng)計學差異（均P ＞ 0.05）；治療48 h后與模型組比較，美托洛爾組 （P = 0.034） 與艾司洛爾組 （P = 0.027） 心率顯著降低，而美托洛爾組 （P = 0.040） 與艾司洛爾組 （P =0.038） 平均動脈壓顯著升高。見表2。

2.3 各組大鼠治療48 h后心肌細胞HE染色結果

表2 各組大鼠治療前 （0 h） 、治療24、48 h 后心率和平均動脈壓比較Tab.2 Heart rate and mean arterial pressure in the four groups after modeling

結果顯示，治療48 h后對照組大鼠心肌細胞組織致密，未見明顯血管擴張；電鏡下可見肌纖維排列有序，線粒體、肌漿網(wǎng)規(guī)則可見。模型組大鼠心肌細胞排列疏松，細胞間可見炎癥細胞浸潤；電鏡下細胞肌纖維斷裂，線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)辨認困難。美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細胞形態(tài)接近對照組大鼠心肌細胞，但仍見充血和炎癥細胞浸潤；電鏡下可見心肌細胞肌纖維束排列有序，線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)可見但有部分異常。表明β受體拮抗劑可以一定程度恢復膿毒癥模型大鼠心肌細胞線粒體的損傷。見圖1。

2.4 各組大鼠心肌組織線粒體內膜ANT mRNA及蛋白表達比較

結果顯示，治療48 h后，心肌組織線粒體內膜ANT的表達水平與模型組 （0.7±0.3） 比較，美托洛爾組 （1.6±0.6，P = 0.017） 和艾司洛爾組 （1.7±0.7，P = 0.018） ANT mRNA表達水平顯著增高；Western blotting 檢測結果顯示，與模型組比較，美托洛爾組和艾司洛爾組ANT蛋白水平也增高 （圖2） 。表明β受體拮抗劑對治療膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體具有一定保護作用。

3 討論

圖1 各組大鼠治療48 h后心肌HE染色及線粒體觀察Fig.1 Appearance of the mitochondria at 48 h after treatment visualized by HE staining

圖2 各組心肌組織 ANT蛋白表達比較Fig.2 Myocardial ANT protein expression in each group

膿毒癥可以導致明顯的心肌損傷，本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型大鼠心肌細胞疏松，排列出現(xiàn)紊亂，細胞間可見炎癥細胞浸潤，電鏡下可以見到明顯的肌纖維斷裂，線粒體結構受到不同程度的破壞。而美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細胞排列恢復有序，電鏡下可見線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)恢復接近正常形態(tài)。美托洛爾組和艾司洛爾組心肌組織ANT mRNA和蛋白表達水平均顯著高于模型組 （均P ＜0.05） ，表明β受體拮抗劑對膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體的損傷具有一定緩解或者保護作用。

革蘭陰性桿菌感染是引起膿毒癥的主要原因，細菌內毒素是革蘭陰性細菌的細菌壁成分，在敗血癥、多臟器功能衰竭 （multiple organ failure，MOF） 發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。膿毒癥、感染性休克患者的心肌存在Toll樣受體 （Toll-like receptor，TLR） 表達，內毒素可引起心肌細胞產(chǎn)生IL-1 β和TNF-α增加，上調TLR mRNA水平，并降低心肌的收縮性［14］。相反心肌TLR4表達缺乏的動物則對內毒素反應減弱，心肌功能影響減少［15］，敲除TLR4基因的大鼠注射內毒素后也可觀察到心臟功能障礙弱于野生型［15］。此外TLR4可還可以通過激活MyD88和IFN-β，調節(jié)PI3K/Akt信號轉導［16］，而PI13K/Akt信號轉導通路可調整心肌細胞的生長和生存，該通路的活化可抑制心肌細胞凋亡。TLR介導的信號轉導導致血清TNF-α、IL-1 β濃度增加，并引起心肌線粒體功能障礙。另一方面，TNF-α與心肌細胞膜特異受體結合，促進內質網(wǎng)釋放過多鈣離子，心肌線粒體鈣離子內流增加，鈣離子在線粒體內積聚、鈣超負荷，最終可導致線粒體腫脹、破壞，在肺血管內皮細胞中觀察到存在相似的過程［17］。TNF-α還可通過啟動心肌線粒體凋亡信號，使患者心肌線粒體通透性轉換孔呈高通透狀態(tài)，H+內流，導致線粒體膜電位缺失，線粒體腫脹、破裂［18］。以上研究表明心肌細胞線粒體可能在膿毒癥心臟功能損傷中發(fā)揮重要作用，與本研究結果一致。

美托洛爾、艾司洛爾是常用的β受體拮抗劑，研究［19］發(fā)現(xiàn)β受體拮抗劑可以促進重度膿毒癥患者心率控制、降低死亡率并有效調節(jié)酸堿常數(shù)。另外一項近期的基于醫(yī)療護理數(shù)據(jù)的回顧性研究［9］表明β受體拮抗劑可以降低膿毒癥患者31%醫(yī)院死亡率以及41%的30 d死亡率。以上研究說明β受體拮抗劑有利于緩解膿毒癥患者的心臟功能損傷。本研究發(fā)現(xiàn)應用美托洛爾和艾司洛爾可以緩解膿毒癥大鼠的心肌細胞線粒體形態(tài)損傷，使ANT的表達水平增高，表明β受體拮抗劑對于膿毒癥心肌細胞線粒體的損傷有保護作用。這可能的機制包括：（1） 慢性心力衰竭患者可出現(xiàn)心肌細胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶 （SERCA）和Na+/Ca2+泵 （NCX） 表達異常，可能影響攝取和釋放Ca2+，導致心肌收縮、舒張功能異常，而β受體拮抗劑可以調節(jié)心肌細胞Ca2+調整蛋白的表達，從而改善心肌細胞Ca2+動力學，提高心肌細胞功能［18］；針對膿毒癥大鼠心肌細胞，β受體拮抗劑也有可能通過對SERCA和NCX的保護作用來減少線粒體Ca2+超負荷的發(fā)生，從而達到保護線粒體的作用； （2） β受體拮抗劑可以降低膿毒癥心肌線粒體的不飽和脂肪酸指數(shù)以及氧化應激，從而影響線粒體功能［20-21］。

綜上所述，β受體拮抗劑對膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體損傷具有一定保護作用，這將為膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體損傷的預防和治療提供新的研究方向。本研究不足之處：（1） β受體拮抗劑對于膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體的保護作用的分子機制未進一步深入闡明； （2） 本實驗觀察周期較短。因此，以后將進一步探索β受體拮抗劑對于膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體的長期保護作用以及具體的分子機制。