陳 媛, 鄭慶禮, 李春燕, 袁曉琴, 王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院, 福建 福州 350002)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為主要特征[1].PEDV首次在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)[2],而后在泰國(guó)、越南南部、菲律賓、中國(guó)等亞洲國(guó)家也報(bào)道了許多有關(guān)PEDV的流行情況.

PEDV的核酸為單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)為27000～33000個(gè)NT，其5′端存在一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，3′端則有一個(gè)Poly(A)尾[3]，在3′4 kb區(qū)域內(nèi)有4個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)，其中N、sM、以及M等結(jié)構(gòu)蛋白主要由上游ORF3編碼，M蛋白是一個(gè)可以在病毒粒子的組裝和出芽、刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α-干擾素甚至可以中和病毒(前提是有補(bǔ)體存在)等方面發(fā)揮作用且具有高度保守性一種跨膜蛋白，因此把M蛋白列為PEDV基因工程疫苗的候選基因[4].S蛋白是一種糖蛋白，它位于病毒的表面，有識(shí)別靶細(xì)胞，促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合，刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體等作用，而且，它與病毒在體外的生長(zhǎng)有關(guān)，能減弱病毒在體外的毒力,在疫苗的領(lǐng)域成為主要目的蛋白用于防治PEDV的爆發(fā).

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于單基因和多基因共表達(dá)的研究均取得一定進(jìn)展，如張博等[5]成功構(gòu)建了PEDV部分N基因原核表達(dá)載體，常宏賞等[7]成功構(gòu)建了pet-32a-S質(zhì)粒，崔光亞[7]成功構(gòu)建了串聯(lián)重組質(zhì)粒pET-HBHA-HSP65，王國(guó)卿等[8]成功構(gòu)建了PET-32a(+)-2Tβ4，但目前對(duì)PEDV的多基因共表達(dá)研究仍未見詳細(xì)報(bào)導(dǎo).

本試驗(yàn)旨在通過構(gòu)建串聯(lián)重組質(zhì)粒，篩選誘導(dǎo)表達(dá)的條件，為后期獲得重組蛋白、新型疫苗、多克隆抗體以及PEDV致病機(jī)理的研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

DH-5α和E.coliBL-21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京金式金生物技術(shù)有限公司，重組質(zhì)粒Pet-32a-M由本試驗(yàn)構(gòu)建保存于-20 ℃.

主要試劑有HindⅢ QuickCut、NotⅠ QuickCut限制性內(nèi)切酶(賽默飛世爾科技公司)，高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(維真生物科技有限公司)、RNA提取試劑盒(哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司).

1.2 引物設(shè)計(jì)

按照GenBank登錄的PEDV S蛋白基因序列(KU363117.1)，選擇主要抗原位點(diǎn)并去除稀有密碼位置，通過Oligo7設(shè)計(jì)引物，送至測(cè)序公司合成.

上游引物F：5′-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3′(HindⅢ);下游引物R：5′-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3′(NotⅠ).

1.3 目的基因擴(kuò)增

取PEDV陽(yáng)性病料剪碎并磨成漿液，重復(fù)凍融至少3次，以10000離心15 min，吸出上清，用RNA病毒提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后,取1 μL作為模板，加10 mmol·L-1PCR Nucleotide Mix 12.5 μL,Nuclease-Free Water 9.5 μL,上下游引物各1 μL.反應(yīng)條件為95 ℃ 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min ,進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳.采用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物.

1.4 串聯(lián)表達(dá)載體PET-32a-M-S的構(gòu)建

用HindⅢ和NotⅠ分別對(duì)膠回收產(chǎn)物和Pet-32a-M進(jìn)行雙酶切，80 ℃滅活30 min，按照目的基因∶質(zhì)粒=7∶1的比例，置4 ℃冰箱T4連接酶過夜連接.

1.5 串聯(lián)重組質(zhì)粒鑒定

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行過夜培養(yǎng)，挑取2個(gè)白色單克隆菌落，分別以4對(duì)引物：目的基因(F、R)、T7(F、R)、目的基因(F)+T7(R)和目的基因(R)+T7(F)進(jìn)行PCR鑒定.待鑒定正確，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢ和NotⅠ酶切鑒定及測(cè)序鑒定.經(jīng)鑒定正確后，將串聯(lián)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL-21中.

1.6 串聯(lián)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)體系優(yōu)化

將保存的陽(yáng)性克隆菌復(fù)蘇，按照1∶100的比例接種于LB培養(yǎng)基Amp+，250 r·min-1，37 ℃搖床中培養(yǎng)至D600 nm=1時(shí)，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1的IPTG，在時(shí)間和T不變的情況下，取15 μL樣品跑SDS-PAGE電泳，最后得到最佳的誘導(dǎo)濃度.

最佳誘導(dǎo)濃度和溫度不變，設(shè)置2、4、6、8、10 h等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行搖菌，而后取樣進(jìn)行蛋白變性，取15 μL樣品SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果.

最佳誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間不變，設(shè)置4、25、37、45 ℃等溫度進(jìn)行搖菌，而后取樣進(jìn)行蛋白變性，取15 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果.

1.7 重組串聯(lián)蛋白的Western blot鑒定

將1.6步驟中誘導(dǎo)表達(dá)的串聯(lián)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，利用轉(zhuǎn)印槽將目的條帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維素膜，隨后于濕盒中37 ℃孵育一抗(抗His和抗PEDV陽(yáng)性血清)、二抗，底物顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DL2000 DNA Marker 1：S基因的擴(kuò)增產(chǎn)物.圖1 S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of S gene by PCR

以S基因的上游(S-F)、下游(S-R)為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳分析，可以明顯看到1條約為639 bp的特異性條帶(如圖1)，與預(yù)期的結(jié)果相符.

2.2 串聯(lián)重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

按照1.5步驟操作，結(jié)果表明(圖2A)，大約在639、844、1 943和2 086 bp處有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相符.酶切鑒定(如圖2B)顯示連入S基因的串聯(lián)質(zhì)粒比只連入M基因的重組質(zhì)粒的位置要來的高，單酶切后顯示的條帶位置和預(yù)期的一樣，分別用BamHⅠ和SalⅠ、HindⅠ和NotⅠ對(duì)串聯(lián)重組的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，在697和639 bp的位置上得到目的片段，同時(shí)用M基因(BamHⅠ)+S基因(NotⅠ)進(jìn)行酶切，在1 330 bp的位置上出現(xiàn)了條帶，和預(yù)期的片段長(zhǎng)度相同.鑒定結(jié)果表明，PEDV S蛋白已成功克隆至重組質(zhì)粒Pet-32a-M中.測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，串聯(lián)重組質(zhì)粒(Pet-32a-S-M)成功構(gòu)建.

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

M:蛋白marker;1:PET-32a誘導(dǎo)組;2:pET-32a-M-S未誘導(dǎo)組;3:pET-32a-M-S誘導(dǎo)組.圖3 E.coli BL21(DE3)中重組pET32a-M-S蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.3 The analysis of protein pET-32a-M-S expression in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE

本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pet-32a-M質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白約43.6 ku(包括標(biāo)簽多肽蛋白20 ku)，而S蛋白的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量約23.4 ku，SDS-PAGE電泳分離結(jié)果顯示(圖3)，pET-32a-M-S串聯(lián)重組質(zhì)粒菌在IPTG的誘導(dǎo)下，在(15～25 ku)和(35～45 ku)這兩個(gè)區(qū)間各有1條明顯的條帶，而空質(zhì)粒對(duì)照組在這兩個(gè)區(qū)間沒有出現(xiàn)該特異性條帶.將pET-32a-M-S未誘導(dǎo)組(2)和pET-32a-M-S誘導(dǎo)組(3)進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后S蛋白出現(xiàn)的特異性條帶比未誘導(dǎo)組所出現(xiàn)的條帶粗，而誘導(dǎo)后M蛋白呈現(xiàn)的條帶也比未誘導(dǎo)組所出現(xiàn)的條帶粗且亮.

2.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果

在37 ℃條件下，隨著IPTG濃度的改變，結(jié)果(如圖4a)顯示，IPTG終濃度為0.6 mmol·L-1誘導(dǎo)條件下，M蛋白條帶最粗、最亮(43.6 ku)，S蛋白條帶偏亮(23.4 ku)，即在0.6 mmol·L-1下蛋白重組表達(dá)量最佳.

A：M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空載組誘導(dǎo)組；2～7：分別為IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，梯度下誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌組；B：M:蛋白 marker；1：空載誘導(dǎo)組；2～6：分別為誘導(dǎo)后2，4，8，10 h梯度下誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌組；C： M：蛋白Marker1：空載誘導(dǎo)組 2-5分別在4、16、25、37 ℃梯度下的誘導(dǎo)組.圖4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件SDS-PAGE電泳圖Fig.4 Electrophoresis identification of recombinant protein under various expression condition

以終濃度為0.6 mmol·L-1，溫度37 ℃不變?yōu)榍疤?，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的改變，蛋白表達(dá)量不同，(如圖4b)可以看出在8h時(shí)M蛋白和S蛋白的條帶達(dá)到最亮最粗，即在此條件下M蛋白和S蛋白表達(dá)量最佳.

在IPTG終濃度為0.6 mmol·L-1條件下，誘導(dǎo)8 h不變的條件下，并分別放置于4、16、25、37 ℃溫度梯度下進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)果(如圖4c)所示，在25 ℃條件下M蛋白的條帶相對(duì)于其它溫度誘導(dǎo)的蛋白條帶亮更粗，而S蛋白誘導(dǎo)的蛋白條帶也相對(duì)其它溫度下的誘導(dǎo)出來的條帶更亮.因此，25 ℃為pET-32a-M-S串聯(lián)質(zhì)粒的最適誘導(dǎo)溫度.

2.5 Western-blot鑒定結(jié)果

為驗(yàn)證上述步驟最終得到的蛋白是否為預(yù)期的目的蛋白，以His·Tag標(biāo)簽蛋白的抗體作為一抗，對(duì)誘導(dǎo)變性后的蛋白進(jìn)行Western blot分析.結(jié)果如圖5A所示，串聯(lián)重組質(zhì)粒菌組和空質(zhì)粒菌組分別在約43.6、23.4和20 ku的位置出現(xiàn)了特異性條帶，而空載菌組未出現(xiàn)任何條帶.同時(shí)以PEDV陽(yáng)性血清的抗體作為一抗，對(duì)誘導(dǎo)變性后的蛋白再次進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果(如圖5B)可見，空載誘導(dǎo)組在35～45 ku和25 ku處均未出現(xiàn)明顯的特異性條帶，而串聯(lián)重組質(zhì)粒組在這兩個(gè)區(qū)間有明顯的特異性條帶的出現(xiàn).由此可進(jìn)一步表明M-S蛋白在體外成功被串聯(lián)表達(dá).

A:Anti-HIS：1.空載誘導(dǎo)組2:25 ℃；血清：1：空載誘導(dǎo)組2：25 ℃;B:Anti-HIS：1.空載誘導(dǎo)組2:25 ℃；血清：1：空載誘導(dǎo)組2：25 ℃.圖5 重組蛋白的免疫印記鑒定電泳圖Fig.5 Electrophoresis of recombinant protein identified by Western Blot

3 討論

(1)自2010年以來，PEDV的流行出現(xiàn)了上升的趨勢(shì)，即使接種了PRDV二聯(lián)苗和弱毒苗進(jìn)行免疫預(yù)防，仍無法使豬場(chǎng)避免該病的發(fā)生[9]，多個(gè)研究表明，隨著單個(gè)堿基的改變或缺失都會(huì)使毒株之間的免疫原性發(fā)生改變，而該病毒的S蛋白自身也存在29個(gè)潛伏的N-糖基化位點(diǎn)，這也是容易發(fā)生變異的關(guān)鍵因素[10].

(2)當(dāng)S基因發(fā)生變異時(shí)，其刺激宿主產(chǎn)生中和抗體降低，對(duì)識(shí)別相應(yīng)毒株的能力減弱，造成其制備的單個(gè)蛋白的疫苗效價(jià)降低，而單個(gè)M基因的構(gòu)建[11]，其制備的M蛋白也只能應(yīng)對(duì)單一的情況，一旦有新的疫情發(fā)生，都無法使各類的豬獲得較好的免疫.由此，提出假設(shè)是否能體外同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)出2個(gè)蛋白，本試驗(yàn)將S蛋白和M蛋白進(jìn)行串聯(lián)，經(jīng)一系列的鑒定，成功體外誘導(dǎo)了串聯(lián)蛋白，串聯(lián)蛋白作為新型疫苗，其表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)量大，免疫原性更強(qiáng)，效果是單聯(lián)蛋白的1倍甚至更多，與單聯(lián)蛋白的區(qū)別在于，單聯(lián)蛋白在變異株間免疫作用局限小，甚至完全失效，而串聯(lián)蛋白由2段基因的蛋白構(gòu)成，變異株間的免疫作用相對(duì)較大，即使S基因有部分發(fā)生改變，仍能在控制范圍內(nèi).

(3)今后，將重點(diǎn)對(duì)串聯(lián)蛋白的純化以及誘導(dǎo)機(jī)體中和抗體產(chǎn)生的功能進(jìn)行研究.