萬春和, 劉榮昌, 陳翠騰, 程龍飛, 施少華, 傅光華, 陳紅梅, 傅秋玲, 黃 瑜

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心/福建省禽病防治重點實驗室，福建 福州 350013)

鴨瘟病毒(duck enteritis virus, DEV)，也稱鴨腸炎病毒，屬皰疹病毒科(Herpesviridae)α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesviridae)馬立克氏病病毒屬(Mardivirus)[1].鴨群感染DEV主要表現(xiàn)為體溫升高、兩腿發(fā)軟、流淚，部分鴨感染可見“腫頭瘟”；剖檢主要出現(xiàn)食道黏膜出血或潰瘍、泄殖腔黏膜出血等癥狀.DEV可感染鴨、鵝和其他雁形目禽類[2-3].

目前，GenBank數(shù)據(jù)庫中登陸了6株DEV全基因組，其基因組長度約160 kb(158 015～162 175 bp).DEV基因組由長獨特區(qū)(unique long, UL)、短獨特區(qū)(unique short, US)及位于US區(qū)兩端的內(nèi)部重復(fù)序列(internal repeat, IR)和末端重復(fù)序列(terminal repeat, TR)組成，其基因組結(jié)構(gòu)UL-IR-US-TR具有典型的皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)特征[4-9].DEVgE基因全長1 473 bp，編碼490個氨基酸，在DEV不同代表株中極為保守，僅存在個別點突變[10].gE蛋白是DEV重要的囊膜蛋白，該蛋白亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)，具有良好的免疫原性和反應(yīng)活性[11-12].研發(fā)發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒科豬偽狂犬病毒在非同源細(xì)胞系中傳代易導(dǎo)致gE和gI基因丟失，造成毒力顯著下降，具有良好的弱毒活疫苗潛力[13-14].對DEV的研究發(fā)現(xiàn)，DEV強(qiáng)毒株(CSC株)經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)傳代后致弱毒株(p80株)第25～100代均穩(wěn)定缺失gE基因[8].但對GenBank數(shù)據(jù)庫中的3株DEV疫苗株[VAC株(登錄號：EU082088)、K株(登錄號：KF487736)、C-KCE株(登錄號：KF263690)]和3株強(qiáng)毒株[CHv株(登錄號：JQ647509)、CV株(登錄號：JQ673560)、2085株(登錄號：JF999965)]基因組分析發(fā)現(xiàn)， DEV強(qiáng)毒株和疫苗弱毒株均存在gE基因，表明gE基因?qū)EV毒力致弱的生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究.

DEV的診斷常見有病毒分離與鑒定、血清中和試驗(SN)、瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附、微量固相放射免疫吸附試驗(Micro-SPRIA)和反向間接血凝試驗(RPHA)等經(jīng)典病毒學(xué)方法.隨著對DEV基因序列不斷深入研究，針對DEV多個基因序列特征的PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)和實時熒光定量PCR方法均有研究報道[15-17]；此外，針對gE基因檢測DEV的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光和免疫組化方法等相關(guān)研究[11-13].本試驗基于gE基因特征分析，設(shè)計特異性引物和探針，建立了基于TaqMan探針檢測DEV的實時熒光定量PCR方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 病毒核酸提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit(貨號：ER201)、細(xì)菌基因組提取試劑盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(貨號：EE161)、熒光定量PCR反應(yīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(貨號：AT341)和T克隆載體試劑盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit(貨號：CT111)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量試劑盒Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(貨號：RR390Q)和PCR擴(kuò)增試劑Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)(貨號：RR902Q)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒(貨號：Gel Extraction Kit D2500)和質(zhì)粒小量提取試劑盒Ⅰ(貨號：Plasmid Mini Kit Ⅰ D6943)均購自O(shè)mega Bio-Tek公司；熒光定量八排管(貨號：PCR-0208-C)購自愛思進(jìn)(Axygen)公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑、耗材和引物合成購自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.1.2 毒株和菌株 番鴨細(xì)小病毒(muscovy duck parvovirus, MDPV)、鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus, GPV)、鴨腺病毒A型(duck adenovirus A, DAdV-A)、鴨甲肝病毒1型(duck hepatitis A virus 1, DHAV-1)、鴨甲肝病毒3型(duck hepatitis A virus 3, DHAV-3)、番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus, MDRV)、新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus, N-DRV)、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus, AIV)、禽1型副粘病毒(avian paramyxovirus type 1, APMV-1)、鴨源大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、鴨疫里默氏桿菌(Rimerellaanatipstifer,R.A.)和鴨源禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.M.)均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鑒定并保存.

DEV疫苗株購自青島易邦生物工程有限公司，疫苗株為DEV雞胚化弱毒株(CVCC AV1222)，批號:160051201，生產(chǎn)日期：20161020.

1.1.3 試驗胚 7日齡非免疫半番鴨鴨胚購自莆田某健康養(yǎng)殖廠.

1.2 TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中DEV各分離株gE基因的特征，采用Oligo(v7.37)引物設(shè)計軟件，設(shè)計特異性的TaqMan實時熒光定量PCR的引物和探針，上游引物DEV-gE-F：5′-AAGGGTATAGGGTTAAGAC-3′，下游引物DEV-gE-R：5′-GGTGTAGATTCGGTAGAC-3′，熒光探針DVE-gE-P：5′-ACGAATCCTCAGAACACAGACTCAG-3′.其中，DVE-gE-P的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)Eclipse.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 采用Oligo(v7.37)引物設(shè)計軟件，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增DEVgE基因，上游引物DEV-gE-F：5′-GACTACGGAACCTCAACAATT-3′，下游引物DEV-gE-R：5′-TGAGTCATTAGTTCAACATCCAT-3′.該引物擴(kuò)增片段跨過完整的gE基因開放閱讀框(ORF)，預(yù)期目的片段大小為1 525 bp.

采用病毒核酸提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取DEV強(qiáng)毒株(FZ1501株)[18]核酸DNA，使用gE基因全長引物(DEV-gE-F/DEV-gE-R)對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增.按照Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)參考試劑盒說明書配制，含25 μL 2×Ex Taq SuperMix、上/下游引物(DEV-gE-F/DEV-gE-R, 20 μmol·L-1)各1 μL、1 μL提取核酸DNA，補(bǔ)充22 μL滅菌去離子水至終體積50 μL.混勻，瞬時離心后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸10 min.

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，對特異性目的片段進(jìn)行切膠后采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化.按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆連接試劑盒說明書將特異性的基因片段克隆到pEASY-T1載體上，隨機(jī)挑取12個單菌落于氨芐青霉素(含量為100 μg·mL-1)抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h后，采用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取相應(yīng)的質(zhì)粒.采用PCR擴(kuò)增時的引物(DEV-gE-F/DEV-gE-R)和條件對提取的質(zhì)粒(需稀釋105倍)進(jìn)行PCR鑒定，將篩選出的陽性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序.將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上進(jìn)行DNA數(shù)據(jù)庫相似性比較(BLAST)，符合試驗預(yù)期的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)線性化酶切后作為實時熒光定量PCR的陽性標(biāo)準(zhǔn)品(T-gE).采用微量核酸測定儀測定陽性重組質(zhì)粒的濃度，計算出拷貝數(shù)(2.17×108拷貝·μL-1)，先將其稀釋至1.0×108拷貝·μL-1，再對其進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋(質(zhì)粒含量分別為1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101和1.0×100拷貝·μL-1)，分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化 以陽性標(biāo)準(zhǔn)品(T-gE)(質(zhì)粒含量為1.0×106拷貝·μL-1)為模板，按照Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)試劑盒說明書配制20 μL的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，在不同引物終濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1)、不同探針終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)的條件下，對退火溫度(56、58、60、62 ℃)進(jìn)行優(yōu)化，以出現(xiàn)最高的熒光值(△Rn)、最小的循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold, Ct)以及在熔解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，確定建立的實時熒光定量PCR的最優(yōu)反應(yīng)條件.

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以不同質(zhì)粒含量(1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝·μL-1)的標(biāo)準(zhǔn)品作為實時熒光定量PCR反應(yīng)的模板，用“1.2.3”中優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動力學(xué)曲線.以標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，以Ct為縱坐標(biāo)，推導(dǎo)計算出實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程(標(biāo)準(zhǔn)曲線).

1.2.5 特異性試驗 用優(yōu)化后的最優(yōu)反應(yīng)條件分別對其他常見的鴨源病原(MDPV、GPV、DAdV-A、DHAV-1、DHAV-3、MDRV、N-DRV、AIV、APMV-1、E.coli、R.A.、P.M.)進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，評價建立方法的特異性.以DEV雞胚化弱毒株(CVCC AV1222株)和強(qiáng)毒株(FZ1501株)為陽性對照，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取相應(yīng)的病毒株(CVCC AV1222株、FZ1501株、MDPV、GPV、DAdV-A)核酸DNA，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取相應(yīng)菌株(E.coli、R.A.、P.M.)基因組DNA，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取相應(yīng)病毒株(DHAV-1、DHAV-3、MDRV、N-DRV、AIV、APMV-1)核酸RNA后使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用.

1.2.6 敏感性試驗 分別以不同質(zhì)粒含量(1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝·μL-1)的標(biāo)準(zhǔn)品作為實時熒光定量PCR反應(yīng)的模板，用“1.2.3”中優(yōu)化后的最優(yōu)實時熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，確定建立的實時熒光定量PCR方法的最小檢測限，同時進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，評價兩者的靈敏性.

1.2.7 重復(fù)性試驗 用優(yōu)化后的最優(yōu)實時熒光定量PCR反應(yīng)條件分別對不同質(zhì)粒含量(1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝·μL-1)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，每個含量的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測3次，計算組內(nèi)變異系數(shù).分別將上述標(biāo)準(zhǔn)品分裝后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，共檢測3次，計算組間變異系數(shù).

1.3 臨床應(yīng)用

1.3.1 臨床樣品檢測 用優(yōu)化后的最優(yōu)實時熒光定量PCR反應(yīng)條件，對臨床送檢疑似DEV感染的14份病死鴨進(jìn)行檢測，并與常規(guī)PCR方法、鴨胚病毒分離進(jìn)行平行分析比較.采集病死鴨肝臟和脾臟組織，加入滅菌PBS(體積比為1∶5)研磨處理后，反復(fù)凍融3次，于4 000 r·min-1離心20 min，吸取上清備用.采用病毒核酸提取試劑盒提取14份待檢樣品的核酸DNA，分裝后凍存?zhèn)溆?采用gE基因全長引物(DEV-gE-F/DEV-gE-R)對分離毒株的gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，明確其基因特征.

1.3.2 人工感染鴨檢測 對3只15日齡的番鴨腿肌免疫注射0.5 mL DEV強(qiáng)毒株(FZ1501株)，3 d后采集其肝臟和食道黏膜刮取物，按常規(guī)方法研磨處理后，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取核酸DNA，采用優(yōu)化后的最優(yōu)實時熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)檢測3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化后的TaqMan實時熒光定量PCR條件

優(yōu)化后的TaqMan實時熒光定量PCR最佳反應(yīng)體系(20 μL)含10 μL Premix Ex Taq(Probe qPCR)Mix、上/下游引物(終濃度為300 nmol·L-1)各0.2 μL、2 μL模板，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積20 μL.優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件為： 98 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，62 ℃退火/延伸20 s，40個循環(huán).循環(huán)結(jié)束后，做出對應(yīng)的溶解曲線.

2.2 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 DEV實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for TaqMan real time PCR of DEV

從不同含量質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增動力學(xué)曲線可見，建立的TaqMan實時熒光定量PCR在1.0×101～1.0×106拷貝·μL-1反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999.以每個標(biāo)準(zhǔn)品模板中拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，以Ct為縱坐標(biāo)，獲得基于TaqMan探針檢測DEV實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)方程為：y=-3.480x+37.955，表明建立的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系.

2.3 實時熒光定量PCR的特異性檢測

從擴(kuò)增曲線(圖2)可見，優(yōu)化后的TaqMan實時熒光定量PCR方法僅對DEV強(qiáng)毒株和疫苗株檢測出陽性擴(kuò)增，對其他常見的鴨源病原(MDPV、GPV、DAdV-A、DHAV-1、DHAV-3、MDRV、N-DRV、AIV、APMV-1、E.coli、R.A.、P.M.)均未見陽性熒光信號擴(kuò)增，表明建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法特異性強(qiáng).

2.4 實時熒光定量PCR的靈敏性檢測

用建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法對不同含量質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖3)顯示，最低檢測限為1.0×101拷貝·μL-1(即10拷貝·μL-1)，常規(guī)PCR的檢測限為1.0×103拷貝·μL-1(即1 000拷貝·μL-1)(圖4)，表明建立的實時熒光定量PCR方法較常規(guī)PCR方法更敏感.

2.5 實時熒光定量PCR的重復(fù)性檢測

將不同含量質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗，結(jié)果(表1)顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.62%～1.14%，組間變異系數(shù)為0.69%～2.40%，Ct的變異系數(shù)均在2.5%以內(nèi)，表明建立的實時熒光定量PCR方法重復(fù)性好.

1：DEV強(qiáng)毒株；2：DEV疫苗株；3：試驗對照(MDPV、GPV、DAdV-A、DHAV-1、DHAV-3、MDRV、N-DRV、AIV、APMV-1、E.coli、R.A.、P.M.)因沒有擴(kuò)增信號，無法區(qū)分具體條帶線.圖2 DEV實時熒光定量PCR的特異性Fig.2 Specificity test for TaqMan real time PCR of DEV

1～6:質(zhì)粒含量分別為1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101和1.0×100拷貝·μL-1.圖3 DEV實時熒光定量PCR的敏感性Fig.3 Sensitivity test of real time PCR for DEV

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～6:質(zhì)粒含量分別為1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101和1.0×100拷貝·μL-1.圖4 DEV常規(guī)PCR的敏感性Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR for DEV

拷貝數(shù)組內(nèi)Ct標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%組間Ct標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%1.0×10616.870.110.6716.950.120.731.0×10520.220.130.6220.400.140.691.0×10423.610.170.7423.820.210.901.0×10327.190.230.8427.290.311.131.0×10231.040.311.0131.210.461.481.0×10134.680.391.1435.010.842.40

2.6 臨床應(yīng)用

2.6.1 臨床樣品檢測 用優(yōu)化后的最優(yōu)實時熒光定量PCR方法對臨床送檢疑似DEV感染的14份病死鴨進(jìn)行檢測，檢測出陽性樣品12份，陽性率為85.71%(12/14)；使用常規(guī)PCR方法檢測出陽性樣品10份，陽性率為71.43%(10/14)，且PCR陽性樣品經(jīng)熒光定量檢測也均為陽性，陽性符合率為100%.經(jīng)病毒分離鑒定后獲得8株DEV，陽性率為57.14%(8/14)，且8份分離的病料經(jīng)常規(guī)PCR檢測均為陽性，陽性符合率為100%.對這8份樣品的gE基因進(jìn)行克隆，結(jié)果可見，8株DEVgE基因相互之間的核苷酸序列同源性為100%，與DEV經(jīng)典強(qiáng)毒株CHv(GenBank登錄號：JQ647509)gE基因核苷酸序列的同源性也為100%.

2.6.2 人工感染試驗 分別采集攻毒3 d后番鴨的肝臟和食道黏膜刮取物，按常規(guī)方法研磨處理后，提取核酸，用優(yōu)化的條件進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品檢測3次.結(jié)果經(jīng)計算表明，3只番鴨肝臟和食道黏膜均檢測出陽性擴(kuò)增信號，肝臟中DEV的平均含量為7.47×104拷貝·μL-1，食道黏膜中DEV的平均含量為2.02×105拷貝·μL-1.

3 討論

實時定量PCR方法是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量.TaqMan實時熒光定量PCR方法是指在PCR擴(kuò)增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán).探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5′-3′端外切酶活性將探針酶切降解，導(dǎo)致報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號.與常規(guī)PCR方法相比，該方法自動化程度高、特異性強(qiáng)，可有效避免PCR潛在的污染問題[19-20].

本試驗建立了基于TaqMan探針檢測DEV的實時熒光定量PCR方法，該方法特異性強(qiáng)，對DEV強(qiáng)毒株和疫苗株檢測均出現(xiàn)陽性熒光信號，對常見水禽傳染病病原(MDPV、GPV、DAdV-A、DHAV-1、DHAV-3、MDRV、N-DRV、AIV、APMV-1、E.coli、R.A.、P.M.)均無交叉反應(yīng)(檢測均為陰性)；靈敏度高，最低檢測限僅為10拷貝·μL-1，較常規(guī)PCR方法敏感100倍；重復(fù)性好，組內(nèi)和組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均較低(最高僅為1.14%和2.40%).應(yīng)用建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法對14份臨床送檢疑似樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其陽性率為85.71%(12/14)，與常規(guī)PCR方法、病毒分離鑒定的陽性符合率均為100%，表明臨床送檢疑似樣品感染DEV的癥狀較為典型.2015年以來，我省多地成年番鴨和半番鴨出現(xiàn)典型的鴨瘟感染癥狀，經(jīng)病毒分離鑒定和序列分析證實均為DEV感染[18,21].本實驗室研究證實，當(dāng)前商品化的DEV疫苗株對DEV強(qiáng)毒株可提供有效保護(hù)[18].雖然我省1999—2014年未出現(xiàn)DEV感染，但在當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)的生產(chǎn)實際中仍需按照科學(xué)的免疫程序接種DEV活疫苗，以避免更大的經(jīng)濟(jì)損失.