劉澤發(fā) ，謝 波 ，孫 波 ，孫小武

(1.湖南人文科技學(xué)院 湖南婁底 417000； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院長(zhǎng)沙 410128； 3.湖南雪峰種業(yè)有限公司 湖南邵陽(yáng) 422000)

作物果實(shí)皮色是一個(gè)重要育種性狀，南瓜果皮顏色、果實(shí)形態(tài)具有豐富的多樣性，大部分可以觀賞也可以食用，皮色多樣性已成為南瓜育種中一個(gè)重要的指標(biāo)[1]。果實(shí)皮色遺傳是一個(gè)極其復(fù)雜的性狀，目前果實(shí)顏色方面主要是研究不同皮色間的顯隱性關(guān)系，已有的研究結(jié)果表明，有棱絲瓜赤麻果色是一個(gè)顯性核基因控制的質(zhì)量性狀[2]，甜瓜果皮底色、果肉顏色由單基因控制，黃綠果皮和橘紅色果肉為顯性性狀[3]。相關(guān)研究對(duì)一些果實(shí)顏色相關(guān)基因進(jìn)行了初步定位，絲瓜皮色相關(guān)的基因位點(diǎn)Ws被定位在連鎖群LG6上[4]。在南瓜果實(shí)皮色研究中，向成鋼[5]通過(guò)對(duì)印度南瓜果實(shí)顏色的遺傳研究認(rèn)為，南瓜果實(shí)皮色白色對(duì)其他皮色類型均呈現(xiàn)不同上位性效應(yīng)，黃色相對(duì)綠色表現(xiàn)不完全顯性，認(rèn)為皮色是受核基因控制的質(zhì)量性狀。金丹[6]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)推測(cè)RAPD標(biāo)記AG-10可能與黃色西葫蘆皮色相關(guān)。李曉林等[7]以中國(guó)南瓜親本及F1代作為研究對(duì)象，通過(guò)POD、EST同工酶測(cè)定，認(rèn)為果皮顏色屬于偏父本遺傳。

黃酮具有清除自由基及抗氧化作用，在防治心腦血管疾病、保肝護(hù)肝、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗病毒、消炎、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘等方面有重要作用[8]。南瓜黃酮等方面的研究較少，尤其在資源篩選及評(píng)價(jià)、遺傳分析及分子標(biāo)記QTL定位方面很少涉及，其研究主要集中在南瓜各部位黃酮含量、黃酮提取方法等方面，有研究認(rèn)為，南瓜花中的生物總黃酮含量最高[9]。相關(guān)研究也表明，不同基因型的蔬菜黃酮含量差異較大[10]，這一發(fā)現(xiàn)為通過(guò)蔬菜品質(zhì)育種提高黃酮含量提供了可能。QTL定位研究可以初步確定控制數(shù)量性狀基因的相對(duì)位置和區(qū)域，為相關(guān)性狀的育種提供依據(jù)，如大豆耐低磷性狀的QTL[11]、棉花纖維品質(zhì)QTL[12]、小麥千粒重的QTL[13]。南瓜果實(shí)皮色和果實(shí)外形具有豐富的多樣性，開(kāi)展對(duì)南瓜果實(shí)相關(guān)性狀的遺傳規(guī)律及定位研究，在種內(nèi)或者種間構(gòu)建多樣的遺傳圖譜，可以為南瓜QTL精細(xì)定位、基因組研究等提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)分子標(biāo)記輔助育種、提高南瓜育種效率具有重要意義。筆者采用RSAP、SRAP、SSR標(biāo)記等3種標(biāo)記技術(shù)結(jié)合6世代群體，分析果實(shí)性狀與顏色性狀相關(guān)基因，并進(jìn)行初步基因定位，成功構(gòu)建遺傳框架圖譜，并對(duì)控制南瓜生物黃酮QTL進(jìn)行分析定位，為富黃酮南瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新與新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

由湖南雪峰種業(yè)有限公司瓜菜研究室提供中國(guó)南瓜材料P1(父本，全黃，短棒形，平均果實(shí)長(zhǎng)度7.8 cm，生長(zhǎng)勢(shì)弱，節(jié)間短，坐果節(jié)位低)、P2(母本，全黑，長(zhǎng)棒形，平均果實(shí)長(zhǎng)度17.0 cm，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，節(jié)間長(zhǎng)，坐果節(jié)位高)，2014年春季在湖南婁底和邵陽(yáng)田間種植，構(gòu)建6世代群體，即F1(B-5×A-3)、P1(A-3)、P2(B-5)、BC1F1(F1×A-3、F1×B-5)、F2，株行距為 0.6 m×1.5 m，大棚內(nèi)吊蔓栽培，6月底收獲成熟果實(shí)。2014年秋季在湖南婁底和邵陽(yáng)2個(gè)大棚種植材料，F(xiàn)2種植112株、BC1F1分別種植 162、139 株，F(xiàn)1、P1和 P2分別種植 20 株，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各世代設(shè)置3次重復(fù)，定植20 d后在植株吊蔓時(shí)將植株編號(hào)并提取DNA，取植株幼嫩葉片約0.05 g，用改良CTAB法提取DNA[14]。后續(xù)試驗(yàn)在湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。定植50 d后，于果實(shí)成熟期記錄果實(shí)性狀，試驗(yàn)材料果實(shí)特性如圖1。

圖 1 P1、P2及 F1果實(shí)

1.2 方法

1.2.1 南瓜PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序 SRAP、RSAP擴(kuò)增體系與擴(kuò)增程序參照劉澤發(fā)等[15-16]的方法與程序進(jìn)行。TaqDNA聚合酶、dNTPs等試劑購(gòu)自上海索萊寶公司，引物由上海生物技術(shù)工程有限公司合成。

1.2.2 數(shù)據(jù)記錄及分析 引物篩選時(shí)，以擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度bp差異記錄數(shù)據(jù)，構(gòu)建連鎖圖譜時(shí)，P1帶型記為“A”，P2帶型標(biāo)記為“B”，F(xiàn)1帶型標(biāo)記為“H”，缺少條帶標(biāo)記為“-”。數(shù)據(jù)整理后使用Excel、Mapmaker 3.0、MapDraw 2.1、Joinmap 4.0、WinQTLCart 2.5 等連鎖分析、遺傳作圖、QTL定位分析，連鎖參數(shù)臨界值設(shè)置為L(zhǎng)OD=3.0，以最大圖距50 cM劃分連鎖群和排列基準(zhǔn)距離，用Mapmaker 3.0中Kosambi函數(shù)計(jì)算連鎖值及連鎖距離，作圖數(shù)據(jù)利用連鎖作圖軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，以MapDraw 2.1繪制遺傳距離[17]。

形態(tài)標(biāo)記定位，以皮色黃色統(tǒng)計(jì)為“A”，黑色統(tǒng)計(jì)為“B”，中間型統(tǒng)計(jì)為“H”，將全黃性狀標(biāo)記為yf(yellowfull)，與分子標(biāo)記數(shù)據(jù)結(jié)合進(jìn)行性狀定位，同樣的方法，以果實(shí)短紡錘型統(tǒng)計(jì)為“A”，長(zhǎng)棒形統(tǒng)計(jì)為“B”，中間型統(tǒng)計(jì)為“H”，標(biāo)記為ls(long stick)，將性狀數(shù)據(jù)與分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜上的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)共同分析，并用Mapmaker 3.0軟件分析定位。

南瓜黃酮fl(flavonoids)QTL定位采用微波輔助法[18]提取并測(cè)定全部F2單株果實(shí)及父本、母本、F1植株各5個(gè)果實(shí)生物總黃酮含量，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS Statisics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)分布符合度檢測(cè)。用WinQTLCart 2.5結(jié)合構(gòu)建好的遺傳圖譜進(jìn)行分析，采用復(fù)合區(qū)間作圖(CIM)法，設(shè)置步長(zhǎng)為2.0 cM進(jìn)行全基因組掃描分析，以LOD＞2.5為閾值檢測(cè)與南瓜果實(shí)黃酮性狀相關(guān)的QTL在連鎖群上的位置。

1.2.3 引物來(lái)源及篩選 試驗(yàn)中所用部分引物來(lái)源于南瓜SSR引物，其中美洲南瓜SSR 193對(duì)，中國(guó)南瓜SSR 307對(duì)[19-21]，其余引物為RSAP(119對(duì))和SRAP引物(24對(duì))。

2 結(jié)果與分析

2.1 作圖群體及果實(shí)形態(tài)標(biāo)記遺傳分析

通過(guò)對(duì)田間F2代群體果實(shí)顏色的調(diào)查，果實(shí)顏色全黃株數(shù)為32株，雜合型為55株，全黑為13株，經(jīng)卡平方檢驗(yàn)，果實(shí)全黃分離比與期望值(1∶2∶1)差異極顯著(表1)。說(shuō)明南瓜果實(shí)顏色全黃性狀為具有一定偏分離的偏向父本型的隱性性狀，暫命名為yf(yellowfull)基因。調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，果實(shí)長(zhǎng)度接近母本型單株數(shù)為18株，接近父本型單株數(shù)為32株，雜合型為50株，分離比符合1∶2∶1孟德?tīng)栠z傳規(guī)律(表1)。說(shuō)明長(zhǎng)棒形果實(shí)性狀為單基因控制的隱性性狀，暫命名為ls(longstick)。

表1 果實(shí)形態(tài)標(biāo)記遺傳分離情況

2.2 引物篩選

所用引物包括美洲南瓜SSR引物(193對(duì))，中國(guó)南瓜SSR引物(114對(duì))，其余部分引物為RSAP(119對(duì))和SRAP引物(24對(duì))。以親本為模板，初步篩選出206對(duì)具有多態(tài)性的引物(SSR標(biāo)記101對(duì)、SRAP標(biāo)記19對(duì)、RSAP標(biāo)記86對(duì))。圖2為多態(tài)性 Sm104引物(TGAACTGGGAGAGAG-GTTTGTGTCAGCTTCCTCAGTAGGG)在親本及100株F2代群體中的電泳帶型情況。

2.3 南瓜遺傳圖譜構(gòu)建及果實(shí)性狀定位

篩選分離比基本符合(1∶2∶1)的 93個(gè)標(biāo)記，數(shù)據(jù)通過(guò)Mapmaker 3.0進(jìn)行分析，有4個(gè)標(biāo)記偏分離嚴(yán)重不能上圖，累計(jì)上圖87個(gè)分子標(biāo)記，2個(gè)形態(tài)標(biāo)記，包含18個(gè)連鎖群，圖譜覆蓋基因組1 038.9 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為11.67 cM。最長(zhǎng)的連鎖群為L(zhǎng)Gp11，遺傳總距離為125.6 cM，共9個(gè)分子標(biāo)記，最短的連鎖群LGp18有2個(gè)分子標(biāo)記，遺傳距離為0.5 cM。

yf基因被定位到連鎖群LGp2的末端，連鎖群有4個(gè)分子標(biāo)記，yf兩側(cè)連鎖比較緊密的分子標(biāo)記為rs10-13和rs10-15，連鎖遺傳距離分別為9.9 cM和10.4 cM。ls基因被定位到LGp7連鎖群上，該連鎖群共有5個(gè)分子標(biāo)記，與分子標(biāo)記e2m2連鎖遺傳距離為3.7 cM，與另一側(cè)分子標(biāo)記Sm87遺傳距離較遠(yuǎn)，為27.9 cM(圖3)。

2.4 南瓜果實(shí)生物黃酮fl-QTL定位及遺傳效應(yīng)分析

2.4.1 父本、母本、F1和F2黃酮含量相關(guān)性狀表現(xiàn)南瓜果實(shí)生物黃酮含量在雙親間的表現(xiàn)差異極顯著(表2)，F(xiàn)2代群體中果實(shí)黃酮含量在1.35～38.64 mg·g-1之間，用SPSS 7.0軟件對(duì)果實(shí)黃酮含量頻率進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，峰度為-0.93，偏度為-0.4，峰度、偏度均少于1.0，其頻率分布圖與正態(tài)分布曲線基本吻合，說(shuō)明黃酮果實(shí)含量為一個(gè)連續(xù)變化且沒(méi)有明顯按照比例分離的表型，具有數(shù)量性狀遺傳分布特征(圖4)。

表2 親本與F2黃酮含量

圖4 南瓜F2代果實(shí)黃酮含量正態(tài)分布

2.4.2 南瓜黃酮含量性狀的QTL定位及遺傳效應(yīng)分析 利用WinQTLCart 2.5，閾值設(shè)置為3.0 LOD(約13.82 LR)進(jìn)行復(fù)合區(qū)間全基因組掃描南瓜黃酮含量QTL，共檢測(cè)到3個(gè)與南瓜黃酮含量相關(guān)的QTL，均位于LGp13連鎖群上(大于2.5 cM認(rèn)定存在 QTL)，分別命名為 flQ1、flQ2和 flQ3。在LGp13上flQ1遺傳距離為 6.21 cM，位于 Sp8_12～Sp_129區(qū)段之間，與分子標(biāo)記Sp129距離最短為0.5 cM，flQ2的遺傳距離為13.91 cM，位于Rs_4-12～rs1_10(rs3_10)之間，與分子標(biāo)記 rs1_10(rs3_10)的距離最短為 0.5 cM，flQ3的遺傳距離為39.11 cM，位于 Sm130～rs5_12之間，與分子標(biāo)記Sm130的距離最短為14.2 cM，flQ1、flQ2和flQ3的置信區(qū)間變化分別為3.2～6.6 cM、10.9～14.9 cM和32.7～52.7 cM，QTL貢獻(xiàn)率分別為 46.32%、39.75%和 17.2%(表 3、圖 5、圖 6)。

表3 QTLs在LGp13連鎖群上的分布

圖5 南瓜果實(shí)黃酮含量性狀QTL在LGp13連鎖群上的定位

圖6 fl-QTL作圖

3 討論

南瓜在葫蘆科作物中具有“多樣性之最”的美譽(yù)，南瓜屬(Cucurbita)果實(shí)形狀、顏色等遺傳性狀方面豐富多彩，另外具有多樣的食用、加工方式和寶貴的醫(yī)療保健價(jià)值，在蔬菜、瓜類植物中其多樣性之表現(xiàn)是罕見(jiàn)的。南瓜屬中西葫蘆果實(shí)顏色綠色對(duì)白色為顯性，是質(zhì)量性狀，受1對(duì)核基因控制，分離世代的綠色果實(shí)顏色深淺程度不同，可能受到微效多基因的修飾作用[22]。甜瓜果皮底色和果肉顏色由單基因控制，黃綠果皮和橘紅色果肉為顯性性狀[3]，番茄果色性狀受核基因控制，而色素含量遺傳除受核基因控制外還可能存在胞質(zhì)效應(yīng)[23-24]。筆者對(duì)南瓜全黃(yf)基因進(jìn)行遺傳特性及QTL定位研究，認(rèn)為yf為偏父本的隱性性狀，可以解釋南瓜果實(shí)顏色中全黃顏色南瓜品種和資源偏少，灰色、黑色和具有深色條底色的南瓜資源較多，試驗(yàn)受育種資源限制，未開(kāi)展紅色、黑色果實(shí)遺傳研究，但可以為后續(xù)的關(guān)于南瓜果實(shí)顏色遺傳及顏色多樣性原因提供試驗(yàn)依據(jù)。另外，筆者認(rèn)為南瓜長(zhǎng)棒果實(shí)(ls)為隱性遺傳，也為南瓜果實(shí)形狀育種提供依據(jù)。

南瓜中富含黃酮等功能成分，另外，南瓜中胡蘿卜素、戊聚糖、果膠、甘露醇、葫蘆巴堿等含量豐富，其功能成分對(duì)多種疾病有療效，南瓜多糖是預(yù)防糖尿病的活性成分[25]，在南瓜果肉中，其肌醇含量達(dá)到16.44 mg·g-1[26]，黃酮是一種良好的抗氧化劑，在南瓜花中含量達(dá)到3.04%，葉中的含量為2.51%[27]。目前關(guān)于南瓜富肌醇資源篩選與評(píng)價(jià)及富肌醇品種選育[26]、南瓜多糖提取純化及抗氧化[28]、高鉻南瓜資源篩選、品種選育及南瓜鉻形態(tài)及利用已有系統(tǒng)研究[29-30]，但是在南瓜富黃酮等方面研究較少，尤其在資源篩選及評(píng)價(jià)、遺傳分析及分子標(biāo)記QTL定位方面很少涉及。其研究主要集中在南瓜各部位黃酮含量、黃酮提取方法等方面，有研究認(rèn)為南瓜花中的生物總黃酮含量最高[9]，由于南瓜花在南瓜整個(gè)生物產(chǎn)量中占的比重很少等原因，難以形成大的加工產(chǎn)業(yè)鏈。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)田間F2代群體果實(shí)顏色的調(diào)查，南瓜果實(shí)顏色全黃為具有一定偏分離的偏向父本型的隱性性狀，暫命名為yf基因。長(zhǎng)棒形果實(shí)相對(duì)短棒形果實(shí)為單基因控制的隱性性狀，暫命名為ls基因。

以87個(gè)標(biāo)記連同ls、yf數(shù)據(jù)通過(guò)Mapmaker 3.0進(jìn)行分析，共構(gòu)建18個(gè)群體，圖譜覆蓋基因組1 038.9 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為11.67 cM，最長(zhǎng)的連鎖群為L(zhǎng)Gp11，遺傳總距離為125.6 cM，共9個(gè)分子標(biāo)記。yf基因定位到連鎖群LGp2，連鎖群有4個(gè)分子標(biāo)記，與yf連鎖比較緊密的分子標(biāo)記為rs10-13和rs10-15，連鎖遺傳距離分別為9.9 cM和10.4 cM。ls基因定位到LGp7連鎖群上，該群共有5個(gè)分子標(biāo)記，與分子標(biāo)記e2m2連鎖遺傳距離為3.7 cM，與另一側(cè)分子標(biāo)記Sm87遺傳距離較遠(yuǎn)，為27.9 cM。

南瓜果實(shí)生物黃酮含量為一個(gè)連續(xù)變化的分布且沒(méi)有明顯的按照比例分離的表型，具有數(shù)量性狀遺傳分布特征。共檢測(cè)到3個(gè)與南瓜黃酮含量相關(guān)的QTL，均位于LGp13連鎖群上，分別命名為flQ1、flQ2和flQ3。flQ1、flQ2和flQ3的置信區(qū)間變化分別為 3.2～6.6 cM、10.9～14.9 cM 和 32.7～52.7 cM，QTL貢獻(xiàn)率分別為46.32%、39.75%和17.2%。筆者開(kāi)展南瓜果實(shí)黃酮QTL定位研究，在LGp13遺傳連鎖群初步定位了3個(gè)南瓜果實(shí)黃酮QTL位點(diǎn)(flQ1、flQ2和flQ3)，為開(kāi)展南瓜果實(shí)黃酮數(shù)量性狀精細(xì)定位提供依據(jù)，為富黃酮南瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新及新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。