李 可，金 輝，鄒華芬，高曉敏，閆海霞，王琚鋼

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 廣東湛江 524091；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市環(huán)境監(jiān)測中心站 呼和浩特 010030)

茄子(Solanum melongenaL.)是一種世界性栽培蔬菜，但易遭病害侵襲而造成大面積減產(chǎn)和品質(zhì)下降[1]。茄子褐紋病(Phomopsis blight of eggplant)是由茄褐紋擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis vexans)引起的一種病害，又稱褐腐病、干腐病，與黃萎病(EggplantVerticilliumwilt)、青枯病(Eggplant bacterial wilt)并稱為茄子的三大病害[2]。該病多在高溫多雨季節(jié)發(fā)生，初期并無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)明顯癥狀會(huì)嚴(yán)重影響茄子的商品價(jià)值[3]。依據(jù)陳姍姍等[4]的介紹，茄子褐紋病發(fā)病癥狀為:發(fā)病葉片病斑呈圓形或不規(guī)則形，邊緣暗褐色，中間為灰白色至淡褐色病斑，其輪生許多黑色小點(diǎn)粒；果實(shí)上產(chǎn)生近圓形凹陷病斑，初為淺褐色，后變?yōu)榘岛稚?；病斑上常密生同心輪紋狀排列的小黑點(diǎn)。廣東省作為“南菜北運(yùn)”主產(chǎn)區(qū)之一，冬季潮濕多雨，茄子褐紋病的發(fā)病率高，一般腐果率達(dá)30%～40%，留種田內(nèi)發(fā)病更為嚴(yán)重，給茄子種植戶和育種工作者帶來極大困難[3]。

目前關(guān)于茄子褐紋病的研究相對(duì)較少，Mahadevakumar等[5]調(diào)查了印度卡納塔克邦茄子褐紋病流行的主要時(shí)間、發(fā)病率，并對(duì)病原菌進(jìn)行了分子表征；黃蔓葉片提取物[1]、苯并咪唑[2]和木霉屬真菌(Trichodermaspp.)[3]均被證實(shí)可抑制茄子褐紋病的發(fā)生和病原菌生長；陳姍姍等[4]系統(tǒng)綜述了國內(nèi)茄子抗褐紋病育種工作。但目前茄子在褐紋病病原菌侵染后的生理生化抗性響應(yīng)機(jī)制尚不清楚[6]。從病原菌微生物接觸寄主開始，植物自身會(huì)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)以應(yīng)對(duì)病原菌侵染，抗性響應(yīng)系統(tǒng)越強(qiáng)，植物對(duì)病原菌的抵抗力越高[7]。近年來，大量植物病害相關(guān)研究表明，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)等保護(hù)酶和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)在植物的抗病應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[8-9]；SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)主要的活性氧清除酶，可幫助植物抵抗活性氧帶來的侵害。PPO可催化酚類物質(zhì)氧化成醌，對(duì)病原菌的繁殖起到抑制作用[10]。而POD也被證實(shí)參與苯酚類和植保素等物質(zhì)的合成[11]。PAL是植物抗病代謝過程中莽草酸途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，與細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)素生成和沉淀有關(guān)[12]，可誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁形成物理屏障物，阻止病原菌侵入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而參與植物的抗病過程[9]。

筆者首先對(duì)疑似發(fā)生褐紋病的茄子葉片及果實(shí)中病原菌進(jìn)行分離純化，利用純化病原菌和不同茄子材料進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)，然后測定不同材料的發(fā)病率，根據(jù)發(fā)病率計(jì)算出苗期和結(jié)果期病情指數(shù)。然后測定接種病原菌后的8 d內(nèi)，不同茄子材料葉片內(nèi)SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性及MDA 含量的變化規(guī)律，以期從生理生化水平揭示不同茄子材料對(duì)褐紋擬莖點(diǎn)霉的抗性響應(yīng)機(jī)制，研究結(jié)果可為篩選茄子抗褐紋病品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離純化及鑒定

2016年在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所實(shí)驗(yàn)基地采集癥狀明顯的疑似病果，后續(xù)試驗(yàn)在海南省熱帶作物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將疑似病果用無菌水沖洗干凈后晾干，然后用75%乙醇進(jìn)行表面消毒。用滅菌的解剖刀片在病健交界處切取果實(shí)組織，用吸水紙吸取多余水分，然后將其接種于PDA培養(yǎng)基中[13]，每皿接入5塊發(fā)病組織，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)基之后再進(jìn)行2～3代的繼代培養(yǎng)，純化后的病原菌置于4℃冰箱中備用。

將純化后的病原菌繼續(xù)培養(yǎng)，待其在PDA培養(yǎng)基上長出黑褐色斑點(diǎn)，用滅菌牙簽挑取斑點(diǎn)置于載玻片上，用LEICA DM 2500顯微鏡鏡檢，觀察分生孢子器形狀及孢子大小，并依據(jù)真菌鑒定手冊[14]和中國真菌志[15]中所介紹的菌落形態(tài)、分生孢子器形態(tài)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

1.2 供試茄子材料

供試茄子品種為市售‘黑貴長茄’和‘長豐二號(hào)’。2017年4月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行試驗(yàn)。將茄子種子催芽后播于育苗穴盤，育苗基質(zhì)為丹麥品氏托普泥炭營養(yǎng)土。當(dāng)幼苗第2片真葉完全展平時(shí)，將其移栽至10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中，轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)基地遮陽棚中，以供后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 苗期抗病性鑒定

待茄子苗齡達(dá)60 d時(shí)，采用噴霧法接種[16]，配制孢子濃度為 1×106個(gè)·mL-1病原菌懸浮液[17]，在葉片正反面均勻噴施，用硫酸紙袋將植株葉片套袋2 h以保證病菌孢子全部接種在葉片上。對(duì)照處理噴施等體積無菌水。3次重復(fù)，每次重復(fù)10盆，每盆1株，正常田間管理。接菌10 d后，每隔2 d進(jìn)行1次病情調(diào)查。

葉片侵染的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:

0級(jí):健康，葉片不發(fā)病；

1級(jí):輕微感病，葉片只有1/3面積出現(xiàn)輕微黃色病斑癥狀；

2級(jí):癥狀明顯，葉片只有1/2面積有不規(guī)則形的黃色病斑；

3級(jí):癥狀較重，葉片上有大面積黃色或者褐色病斑，邊緣略有卷枯；

4級(jí):所有葉片都感病，多為褐色枯斑，有少數(shù)葉片凋落；

5 級(jí):整株死亡[5]。

病情指數(shù)計(jì)算公式如下:

1.4 結(jié)果期抗病性鑒定

當(dāng)苗齡達(dá)到60 d時(shí)，將其移栽至規(guī)格為上口直徑40 cm、基部直徑35 cm、高45 cm的花盆中，正常肥水管理，待植株掛果達(dá)到3～6個(gè)，果實(shí)長度約為15～20 cm時(shí)，采用“十字”法進(jìn)行活體果接菌試驗(yàn)[18]，將健康的茄子果實(shí)表面用無菌水沖洗干凈，濾紙拭去多余水分，用滅菌解剖刀在果實(shí)近果蒂5 cm和靠近果尾5 cm處分別劃5 mm×5 mm的“十字”傷口，用直徑6 mm的圓形濾紙片蘸取濃度為1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，再用滅菌鑷子取圓形濾紙片放于果實(shí)“十字”傷口處，然后將其放置在溫度為28～30℃、相對(duì)濕度為70%的氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照為無菌水處理。每株3個(gè)果實(shí)，每盆1株，每次重復(fù)10盆，3次重復(fù)。接菌處理7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，每隔1 d進(jìn)行1次調(diào)查，共調(diào)查5次，統(tǒng)計(jì)發(fā)病果實(shí)上的病斑面積，按病斑面積占茄子果實(shí)單面表面積百分比(LSP)進(jìn)行分級(jí)。根據(jù)蔬菜病蟲害診斷中茄子褐紋病診斷標(biāo)準(zhǔn)[19]診斷病害。

果實(shí)侵染的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[18]:

0級(jí):果實(shí)無發(fā)病；

1級(jí):果實(shí)出現(xiàn)水漬狀病斑，LSP≤10%；

2級(jí):果實(shí)出現(xiàn)淺褐色橢圓形四陷斑10%

3級(jí):果實(shí)出現(xiàn)淺褐色至暗褐色的圓形或者近圓形四陷斑，30%

4級(jí):病果果肉凹陷呈腐爛狀具有明顯的同心輪紋，40%

5級(jí):病果果肉凹陷腐爛，病部密生許多黑色小點(diǎn)粒，LSP>50%。

1.5 葉片生化指標(biāo)測定

將新育好的茄子幼苗按照方法1.3進(jìn)行接菌培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過程中，每次重復(fù)30株進(jìn)行生化指標(biāo)的測定:10株測定SOD、POD和CAT活性，10株測定PPO和PAL活性，10株測定MDA含量。在接菌的 0、2、4、6、8 d 分別取葉片，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定5種防御酶活性和MDA含量。各時(shí)間點(diǎn)變化率計(jì)算公式如下:

正值即為增幅，負(fù)值即為降幅。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2010處理，用SPSS20.0進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)方差分析，使用Origin Pro 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

從茄子疑似病果中分離微生物，在27℃下PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，菌落長滿培養(yǎng)基，再經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)，純化完成，此時(shí)菌落形態(tài)呈白色毛絨狀，均勻分散在培養(yǎng)基上(圖1 a)；繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，在其白色絨毛上發(fā)現(xiàn)了散生的黑色小點(diǎn)(圖1 b)，疑為病原菌的分生孢子器，顯微鏡下觀察，其形狀接近橢圓形(圖 2 a)，大小約為(5～8)μm×(2～8)μm(圖2 b)。依據(jù)菌落形態(tài)、分生孢子器形態(tài)大小以及真菌鑒定手冊和中國真菌志中的描述，確定疑似病果中分離純化的微生物為褐紋病病原菌茄褐紋擬莖點(diǎn)霉。

圖1 茄子褐紋病病原菌在PDA培養(yǎng)基上純化的菌落形態(tài)(a)及分生孢子器(b)

圖2 不同顯微鏡倍數(shù)(a:100倍，b:400倍)下褐紋病菌分生孢子器鏡下形態(tài)

2.2 不同品種苗期和結(jié)果期對(duì)病原菌的抗性

不同品種茄子回接病原菌后，均出現(xiàn)褐紋病感染癥狀。苗期葉片接種后2個(gè)品種的發(fā)病率均較對(duì)照差異顯著，‘黑貴長茄’發(fā)病率達(dá)到64.98%，而‘長豐二號(hào)’為47.61%(圖3-A)，且2個(gè)品種之間存在顯著差異；2個(gè)品種苗期接種后的病情指數(shù)同樣符合此規(guī)律，‘長豐二號(hào)’的病情指數(shù)顯著低于‘黑貴長茄’(圖3-B)。而結(jié)果期回接試驗(yàn)也表明，‘長豐二號(hào)’的果實(shí)發(fā)病率和病情指數(shù)均低于‘黑貴長茄’，且二者之間差異顯著(圖3)。‘黑貴長茄’較‘長豐二號(hào)’更容易發(fā)生褐紋病。因此，將‘黑貴長茄’作為本次研究中的易感褐紋病材料，將‘長豐二號(hào)’為本次研究的較抗褐紋病材料。

2.3 不同抗性茄子感染病原菌后葉片生化指標(biāo)的變化

圖3 茄子苗期及結(jié)果期接種鑒定的發(fā)病情況

接種褐紋病病原菌后，2種茄子的酶活性變化均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢?！L豐二號(hào)’的SOD酶活性變化率一直高于‘黑貴長茄’；在接菌第2天達(dá)到峰值，‘長豐二號(hào)’和‘黑貴長茄’的SOD酶活性變化率分別達(dá)到14.88%和12.26%(圖4-A)。由圖4-B可知，接種后2個(gè)品種茄子的POD酶活性變化率均逐步增加，且酶活性變化率差異顯著；‘長豐二號(hào)’和‘黑貴長茄’的POD酶活性變化率均在接菌4 d后達(dá)到峰值，分別達(dá)到26.31%和15.49%，隨后二者的酶活性變化率逐漸下降。CAT酶活性(圖4-C)和PPO酶活性(圖4-D)的變化規(guī)律和POD酶活性的變化規(guī)律幾乎完全相同。PAL酶活性變化規(guī)律(圖4-E)也與上述3種酶基本類似，不同的是，在接種病原菌第2天后，2種茄子的PAL酶活性值達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)急劇下降趨勢。而由圖4-F可知，接種褐紋病病原菌后2種茄子的MDA含量變化率差異顯著，在接種第4天達(dá)到峰值，二者的變化率分別為21.31%和10.03%，之后MDA含量迅速下降。

圖4 不同抗性茄子接菌褐紋病菌后超氧化物歧化酶(SOD)(A)、過氧化物酶(POD)(B)、過氧化氫酶(CAT)(C)、多酚氧化酶(PPO)(D)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)(E)活性和丙二醛(MDA)(F)含量的變化

3 討論

茄子褐紋病的病原菌為茄褐紋擬莖點(diǎn)霉，這在許多研究中已被證實(shí)[1-5]。本研究從疑似感染褐紋病的茄子果實(shí)中純化培養(yǎng)微生物，菌落、分生孢子器的形態(tài)特征均符合真菌鑒定手冊中的介紹；苗期和結(jié)果期的病原菌回接試驗(yàn)也證實(shí)，2個(gè)品種的茄子在回接微生物后產(chǎn)生了明顯的褐紋病感染癥狀[5]，因此確定純化后的微生物為茄褐紋擬莖點(diǎn)霉。病情指數(shù)是全面考慮發(fā)病率與嚴(yán)重程度的綜合指標(biāo)，和發(fā)病率相比，更能反映植物對(duì)病害的抗性響應(yīng)。和‘長豐二號(hào)’相比，‘黑貴長茄’在回接試驗(yàn)中苗期和結(jié)果期的發(fā)病率比‘長豐二號(hào)’高17.37%和42.99%，而病情指數(shù)則高出0.22和0.4。這表明，‘長豐二號(hào)’不僅能降低褐紋病的發(fā)病率，更主要的是降低了發(fā)病的嚴(yán)重程度。因此在后續(xù)茄子育種工作中，可考慮將‘長豐二號(hào)’作為一個(gè)抗褐紋病材料。

植物體受到病原菌侵染時(shí)可引發(fā)植物產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致氧化脅迫[20]；活性氧對(duì)病原菌有一定的殺傷或抑制作用，產(chǎn)生活性氧的量與其自身的抗性有關(guān)，過多的活性氧則影響植物自身的生理活動(dòng)，引發(fā)植物產(chǎn)生膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]；而SOD、POD及CAT是植物體內(nèi)主要活性氧清除酶[22]。在本研究中，未接菌的2個(gè)處理中，‘長豐二號(hào)’的SOD、POD和CAT酶活性均高于‘黑貴長茄’；接種褐紋病病原菌后，2個(gè)材料葉片內(nèi)的3個(gè)指標(biāo)較各自對(duì)照均有所升高，但‘長豐二號(hào)’的3個(gè)指標(biāo)與對(duì)照(未接菌)相比的增加量要高于‘黑貴長茄’；這表明植株體內(nèi)的保護(hù)酶活性大小與品種的基礎(chǔ)抗性有關(guān)[23]，且‘黑貴長茄’葉片內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)對(duì)來自外界脅迫的響應(yīng)速度較為遲緩。無論是‘長豐二號(hào)’還是‘黑貴長茄’，保護(hù)酶活性在達(dá)到峰值后迅速下降，這意味著植物體內(nèi)的保護(hù)酶對(duì)活性氧的清除能力在一定時(shí)間內(nèi)有效，保護(hù)酶活性過高或者過低并不能一直清除多余活性氧[24]。PPO也被認(rèn)為是植物體內(nèi)活性氧清除酶，但它也是引起植物褐變的主要因素，2種茄子接菌后，葉片內(nèi)PPO酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能與植株體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)有關(guān)[25]。葉片內(nèi)PAL酶活性在接菌第2天達(dá)到最大值，‘長豐二號(hào)’較對(duì)照變化最顯著，PAL酶活性達(dá)到最大。這說明‘長豐二號(hào)’在受到病原菌侵染時(shí)，可以形成更多的木質(zhì)素或者其他抗病的次生代謝產(chǎn)物，來增加自身的抗病性和免疫能力[26]。MDA含量與茄子褐紋病的抗性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，此結(jié)果與前人研究的結(jié)果一致[27]，茄子在受到褐紋病病原菌侵染后，‘長豐二號(hào)’MDA含量的變化率低于‘黑貴長茄’，說明‘長豐二號(hào)’受到病原菌侵害后膜質(zhì)傷害程度小，這與‘長豐二號(hào)’有一個(gè)較強(qiáng)的活性氧清除系統(tǒng)是一致的。