文朝慧，尤 佳，王溪橋，何蘇琴

(1.甘肅出入境檢驗檢疫局 蘭州 730010； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 蘭州 730070)

瓜類蔓枯病又稱“油秧”、“污根”、“莖部流膠病”等，是一種由Didymella bryoniae(Auersw.)Rehm[無性態(tài)為Phoma cucurbitacearum(Fr.:Fr.)Sacc.，異名Stagonosporopsis cucurbitacearum(Fr.)Aveskamp，Gruyter ＆ Verkley][1]引起的危害瓜類作物的世界性病害，可侵染甜瓜、西瓜、南瓜、黃瓜、哈密瓜等多種葫蘆科作物[2-4]。蔓枯病菌自1869年在德國發(fā)現(xiàn)以來，美國、加拿大、荷蘭、瑞典、日本、印度以及我國臺灣等均有該病為害瓜類作物的報道[5-7]。我國新疆、甘肅、上海、浙江、江蘇、陜西等省市自治區(qū)的哈密瓜和西瓜甜瓜產(chǎn)區(qū)有蔓枯病發(fā)生，且大田發(fā)病率普遍在20%～30%，連作地和溫室中高達(dá)80%[3，8-10]。蔓枯病在瓜類作物的整個生育期都能發(fā)生，可為害植株的莖、蔓、葉、花、果實等各部位，造成瓜秧長勢衰弱，果實品質(zhì)下降，減產(chǎn)15%～30%[2-4，11-12]。瓜類蔓枯病具有發(fā)病迅速、防治困難的特點，病原菌可通過種子進(jìn)行長距離傳播[12]，形成異地擴(kuò)散和蔓延，進(jìn)行種子健康檢測是防止該病害發(fā)生發(fā)展的重要手段。

甘肅省河西地區(qū)是我國最大的對外繁育種子基地，國外種子流入多，種子調(diào)運頻繁，只有加強(qiáng)種子健康檢測才能防范外來有害生物的傳入風(fēng)險。在一批進(jìn)境的意大利西葫蘆(Cucurbita pepoL.)種子中發(fā)現(xiàn)顏色不正常籽粒，對種子進(jìn)行檢測后，證實其攜帶病原菌。經(jīng)過病原物的分離培養(yǎng)，通過觀察分離菌株形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀，結(jié)合PCR檢測、致病性測定及rDNA ITS序列分析，對該菌株進(jìn)行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2015年在甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心進(jìn)行。供試西葫蘆樣品為進(jìn)境的意大利西葫蘆種子，樣品編號為125。瓜類蔓枯病菌特異性引物DB17F:5′-GCAGTCAATCCTTATCC-3′， DB17R: 5′-CGAAAGATTGTGTGACC-3′[13]由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品初檢 挑取顏色不正常西葫蘆籽粒用于DNA提取和PCR初檢。籽粒病組織液氮研磨后取0.1 g，利用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA。用引物DB17F/DB17R進(jìn)行PCR檢測，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為556 bp。PCR反應(yīng)體系總體積 25 μL:10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(1.5 mmol·L-1)2 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL，引物(10 μmol·L-1)各 0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.3 μL，DNA模板2 μL，無菌去離子水16.2 μL。反應(yīng)程序為 94℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.0%(w，后同)的瓊脂糖上凝膠電泳，SYBR Safe染色，凝膠成像儀下拍照。

1.2.2 西葫蘆種子中病原菌的分離 取送檢西葫蘆種子中變色的種子及健康種子，1%的次氯酸鈉(NaClO)表面消毒處理5～8 min，無菌水沖洗3次后，在滅菌吸水紙上晾干。于無菌條件下將種子置于PDA培養(yǎng)基平板上，每平板均勻放置2粒，在(25±1)℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，長出的真菌及時轉(zhuǎn)出，并挑取菌絲尖端純化。分離純化得到的菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，置4℃冰箱中保存。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，(25±1)℃培養(yǎng)，觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

1.2.4 致病性測定 將分離獲得的菌株接種于PDA平板中央，(25±1)℃培養(yǎng)4 d，打孔器切取直徑5 mm的菌絲；健康西葫蘆種子用1%的次氯酸鈉(NaClO)表面消毒處理5～8 min，無菌水沖洗3次后，置于27℃溫箱催芽，約24 h后，挑選胚根長約5 mm的發(fā)芽種子移入直徑15 cm的含水濾紙培養(yǎng)皿中，在胚根上貼接直徑5 mm的菌絲塊。每皿放10粒種子，每處理3皿，以貼接不含病原菌的PDA培養(yǎng)基塊的種子為對照；置(25±1)℃溫箱培養(yǎng)，觀察發(fā)病癥狀。對接種發(fā)病部位進(jìn)行組織分離與培養(yǎng)，確認(rèn)致病菌是否與原接種菌株相同。

1.2.5 病原菌的PCR鑒定 將純化的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，無菌水洗下菌落表面菌絲，轉(zhuǎn)接到PD液體培養(yǎng)基中，在25℃、150 r·min-1恒溫水浴搖床上培養(yǎng)3～4 d后，真空抽濾收集菌絲，液氮保存?zhèn)溆谩２捎迷噭┖?E.Z.N.A.Fungal DNA Kit)提取菌絲的基因組DNA。采用特異性引物DB17F/DB17R對病原菌進(jìn)行PCR檢測，同時采用真菌的通 用 引 物 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′， ITS5: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′[14]，對病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用天根DP204-02型純化試劑盒純化回收，對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序(由金唯智生物科技有限公司完成)，序列采用雙向測定。將測得的序列在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，通過同源性比對對病原菌進(jìn)行分子水平鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品初檢

圖1 西葫蘆種子樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果

引物擴(kuò)增西葫蘆種子125的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物為556 bp(圖1)，初檢結(jié)果表明西葫蘆種子125為蔓枯病菌陽性。

2.2 病菌分離與鑒定

在PDA平板上，受感染的西葫蘆種子表面長出灰黑色霉層，種子帶菌率達(dá)到2%，且?guī)ЬN子未發(fā)芽。

純化的菌株ZuSc-1(圖2-A)在PDA培養(yǎng)基上(25±1)℃黑暗下培養(yǎng)，菌落背面初為白色，后期變?yōu)榛液谏z深褐色(圖2-B)；氣生菌絲發(fā)達(dá)，絮狀，中間稠密，略隆起，初為白色，老化后為灰白色，不形成子囊座和分生孢子器。

2.3 致病性測定

菌株ZuSc-1對供試的西葫蘆具有強(qiáng)致病性。接種20 h后，西葫蘆胚根被害率100%；受害胚根發(fā)黃變褐、皺縮腐爛，胚根生長明顯受到抑制，未接種對照無病癥(圖2-C)；7 d后在胚根病組織表面產(chǎn)生許多分散的黑色小點，即蔓枯病菌的分生孢子器(圖2-D)。剪取西葫蘆幼苗病健交界處的發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的重新分離，表面消毒后在PDA培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，獲得與原分離菌形態(tài)一致的菌株，且所有發(fā)病幼苗均能分離到接種病原菌，表明分離獲得的菌株是西葫蘆的病原菌。

圖2 蔓枯病菌的形態(tài)特征及致病性

2.4 分離物PCR檢測

引物DB17F/DB17R在菌株ZuSc-1中擴(kuò)增出約556 bp的單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后(序列號:MG872824)，與GenBank中已公布菌株序列進(jìn)行比對，該序列與Stagonosporopsis cucurbitacearum(異名:Didymella bryoniae)菌株 GSB10(序列號:GQ872462)、菌株 GSB23(序列號:GQ872461)序列同源性為 97%～99%。引物 ITS4/ITS5在菌株ZuSc-1中擴(kuò)增出約600 bp的單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將待測真菌ITS序列(序列號:KM816641)與GenBank中已公布菌株ITS序列進(jìn)行比對，該序列與Stagonosporopsis cucurbitacearum菌株CBS 233.52(序列號:EU167573)、菌株 R-T2(序列號:GU045304)、Didymella bryoniae菌株(序列號:AY293804)序列同源性為100%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定菌株ZuSc-1為Didymella bryoniae。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)真菌系統(tǒng)分類是以形態(tài)學(xué)特征為主要依據(jù)，尤其是子實體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)被用作分類鑒定的典型性狀，但有些種類真菌需較長時間才能獲得其有性或無性器官，有些種類真菌不易形成繁殖結(jié)構(gòu)，以至于不能滿足快速、準(zhǔn)確鑒定的需求；目前，rDNA ITS序列分析和特異性引物PCR擴(kuò)增是真菌鑒定中使用較多的分子生物學(xué)方法[5]。筆者分離獲得的菌株ZuSc-1在PDA培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)孢，因此有必要借助特異性引物、病菌rDNA ITS序列進(jìn)行鑒定。檢測結(jié)果表明，菌株ZuSc-1的rDNA ITS序列與GenBank中瓜類黑腐球殼菌的相應(yīng)序列具有100%的一致性；而特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的序列與GenBank中瓜類黑腐球殼菌的相應(yīng)序列具有97%～99%的一致性。同時，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，還可直接在受侵染植株中檢測病原菌，比常規(guī)檢測縮短時間。

甜瓜蔓枯病菌劃分為 A、As、B-a、B-la、B-b 共5種類型[2]。菌株ZuSc-1與Chiu等[2]描述的A型菌株相似，通常不產(chǎn)孢。但將菌株ZuSc-1接種在西葫蘆胚根組織上，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了分生孢子器，該結(jié)果同王曉東等[15]在黃瓜、打瓜和葫蘆等果實上誘導(dǎo)得到蔓枯病菌的無性子實體具有一致性。

筆者通過分子生物學(xué)檢測和致病性測定，從進(jìn)境西葫蘆種子中檢測到致病菌瓜類黑腐球殼菌Didymella bryoniae，證實了進(jìn)境西葫蘆種子上攜帶瓜類黑腐球殼菌，該菌可造成西葫蘆種子萌發(fā)率降低以及幼苗死亡[12]。蔓枯病是瓜類蔬菜生產(chǎn)中一種毀滅性病害，目前，高效的抗病品種和防治藥劑較少[3，16-17]，進(jìn)口種子攜帶病原物可成為初侵染源，在溫度、濕度適宜的條件下造成病害的發(fā)生、流行，威脅當(dāng)?shù)厥卟松a(chǎn)，因此應(yīng)加強(qiáng)對境外繁育種子的進(jìn)境檢測，以阻止外來病害的傳入、蔓延。