常海燕，嚴(yán)曉敏，張昭萍，吳衛(wèi)華，賈 蓓，吳 超

（南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210008）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTS virus，SFTSV）引起的新發(fā)傳染性疾?。?－3］。在SFTS的發(fā)病過程中，活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血清清蛋白水平、SFTSV-RNA載量、年齡等已被證明是影響SFTS患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4－6］。SFTSV-RNA 基因主要表達(dá)核衣殼蛋白（N蛋白）、Gn和Gc糖蛋白，其中N蛋白是最具免疫原性的抗原，N蛋白特異性抗體在抗病毒過程中通常發(fā)揮著關(guān)鍵作用［7－8］。然而，在SFTSV所致的SFTS發(fā)病過程中，N蛋白IgM抗體的動態(tài)變化及與病情的關(guān)系尚不清楚。

本研究回顧性分析了SFTS患者N蛋白特異性IgM（－）組與IgM（＋）組患者的臨床癥狀，并分析了N蛋白特異性IgM抗體水平與實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，旨在為揭示N蛋白特異性IgM抗體在SFTS發(fā)病過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2017年11月在某院住院治療的SFTS患者為研究對象。從病歷系統(tǒng)中提取患者的住院信息（包括臨床癥狀），從檢驗(yàn)系統(tǒng)中獲取其實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南（2010版）的標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性病程，體溫＞38℃；（2）有蜱蟲接觸史或與SFTS患者有密切接觸史；（3）血小板或白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少；（4）SFTSV核酸陽性。納入患者均自愿參與研究并簽署知情同意書，且已征得南京鼓樓醫(yī)院倫理管理委員會審批同意。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分組 收集30例SFTS患者的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，根據(jù)其在發(fā)病2周時(shí)N蛋白特異性IgM抗體定性結(jié)果將患者分為IgM（＋）組與IgM（－）組；根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度分為輕癥組及重癥組；重癥患者的定義參考Deng等［1］的研究，任何需要入住重癥監(jiān)護(hù)病房并且至少符合以下標(biāo)準(zhǔn)之一的患者均納入重癥患者組：（1）急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征；（2）心力衰竭；（3）急性腎衰竭；（4）腦炎；（5）休克；（6）敗血癥；（7）彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）；（8）死亡。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 SFTSV-RNA 載量的檢測 收集SFTS患者急性發(fā)病期（每隔2 d）血清，使用RNA提取試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從血清樣品中提取RNA，并以健康患者的血清作陰性對照，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒（BGI，中國深圳）檢測SFTSV-RNA載量。

1.2.2.2 N蛋白特異性IgM抗體定性檢測 采用ELISA試劑盒（中山生物技術(shù)公司，中國廣州）進(jìn)行IgM抗體定性檢測。首先取稀釋后的血清樣本100μL（樣品稀釋液90μL＋血清10μL）置于酶標(biāo)孔，37℃孵育40 min，然后用洗滌液洗滌6次；每孔再加入100μL酶結(jié)合物，37℃孵育40 min，然后再用洗滌液洗滌6次；每孔分別加入顯色液A與顯色液B，37℃孵育15 min，在450 nm條件下測量光密度（OD）。如果樣品的OD值大于閾值（截止值），相應(yīng)的孔被認(rèn)為陽性，否則為陰性。

1.2.2.3 N蛋白特異性IgM抗體滴度的檢測 采用傳統(tǒng)的ELISA方法對血清進(jìn)行N蛋白特異性IgM抗體（＋）滴度測定。首先在96孔板中包被N蛋白100μL，4℃冰箱中過夜；然后用0.1%Triton-X的PBS洗滌液200μL洗滌5遍，在4%乳清稀釋緩沖液和5%奶粉的混合液200μL中室溫封閉1 h，然后再洗滌5遍；加入不同稀釋濃度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000）的樣本血清100μL在室溫條件下孵育1 h，再洗滌5遍；每孔中加入稀釋的IgM 抗體100μL在室溫條件下孵育1 h；每孔中依次加入顯色液A、B各50μL，顯色3 min，最后加入25μL終止液使反應(yīng)停止。用全自動多功能酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值，OD值大于正常健康對照兩倍的最大稀釋倍數(shù)被認(rèn)為是最終IgM抗體滴度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況 本研究共納入患者30例，其中男性10例，女性20例，平均年齡55（48，68）歲，其中高熱（＞39℃）患者16例（53.3%），淋巴結(jié)大患者8例（26.7%），病情嚴(yán)重患者10例（33.3%），死亡患者5例（16.7%）。

2.2 N蛋白特異性IgM抗體滴度、SFTSV-RNA的動態(tài)變化規(guī)律 發(fā)病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時(shí)N蛋白特異性IgM抗體滴度分別為8 923（0，0）、22 688（0，16 000），43 407（12 000，64 000），31 764（14 000，48 000）；IgM 抗體滴度在發(fā)病14 d內(nèi)逐漸升高，發(fā)病14 d后開始下降；發(fā)病第10天有15例（50.0%）患者出現(xiàn)IgM抗體，發(fā)病第14天有18例（60.0%）患者出現(xiàn)IgM抗體。發(fā)病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時(shí)患者的SFTSV-RNA 載 量 分 別 為16 504（0，12 609）、1 814 763（0，54 528）、1 960 334（0，2 094）、415.65（0，82）copies／mL；在發(fā)病第13天時(shí)15例（50.0%）患者SFTSV-RNA得到清除，在發(fā)病第14天時(shí)有17例（56.7%）患者SFTSV-RNA得到清除。

2.3 N蛋白特異性IgM（＋）組與IgM（－）組患者臨床特點(diǎn)比較 所有患者起病時(shí)均有發(fā)熱，部分患者出現(xiàn)腹瀉、頭痛、咳嗽、淋巴結(jié)大、神經(jīng)癥狀等，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡。與N蛋白特異性IgM（＋）組患者相比，IgM（－）組患者病情嚴(yán)重、出現(xiàn)精神癥狀者較多，且病死率高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 SFTS患者N蛋白特異性IgM（＋）組與IgM（－）組患者的臨床特點(diǎn)（例）Table 1 Clinical characteristics of N protein specific IgM（＋）group and IgM（－）group（No.of cases）

2.4 N蛋白特異性IgM抗體滴度與SFTSV-RNA載量相關(guān)性 30例SFTS患者按照病情嚴(yán)重程度分為輕癥、重癥兩組；其中輕癥組患者20例，重癥組患者10例；死亡患者5例，均為重癥組患者。兩組患者在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。輕癥組患者出院時(shí)SFTSV-RNA載量均轉(zhuǎn)為陰性；重癥組患者有2例在出院時(shí)SFTSV-RNA載量未見轉(zhuǎn)陰，且2例患者均死亡。輕癥組患者住院期間N蛋白特異性IgM抗體均為陽性，重癥組患者有3例直至出院時(shí)N蛋白特異性IgM抗體仍為陰性，其中2例患者死亡，死亡時(shí)SFTSV-RNA載量很高。發(fā)病第7～9天時(shí)輕癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度高于重癥組患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.08），SFTSV-RNA 載量低于重癥組患者，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.10）；發(fā)病第10～13天時(shí)輕癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度高于重癥組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SFTSV-RNA載量低于重癥組患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.06）。見圖1。

圖1 輕癥組與重癥組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度及SFTSV-RNA載量的比較Figure 1 Comparison of N protein specific IgM antibody titer and SFTSV-RNA load in mild and severe patients

2.5 重癥患者中死亡患者與存活患者IgM抗體和SFTSV-RNA載量特征 重癥組患者按預(yù)后分為存活組和死亡組。存活組患者與死亡組患者在發(fā)病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天時(shí)N蛋白特異性IgM抗體滴度分別為48 000 VS 0、15 000 VS 7 200、96 000 VS 64 000、26 666 VS 12 000；存活組患者在發(fā)病第3～6天SFTSV-RNA載量為15 771 copies／mL，存活組患者與死亡組患者在發(fā)病第7～9天、第10～13天、第14～20天時(shí)SFTSV-RNA載量分別為8 093 673 VS 28 358 018、22 823 VS18 905 345、39 VS3 285 copies／mL。與存活組患者相比，死亡組患者N蛋白特異性IgM抗體滴度低于存活組患者，SFTSV-RNA載量高于存活組患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 N蛋白特異性IgM 抗體滴度、SFTSV-RNA載量與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相關(guān)性 采集30例SFTS住院患者發(fā)病后不同時(shí)間階段（第0～2天、第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天）的血清，檢測其SFTSV-RNA載量、N蛋白特異性IgM抗體滴度、凝血功能指標(biāo)、肝病酶學(xué)及心肌酶譜。檢測結(jié)果顯示N蛋白特異性IgM抗體水平與SFTSVRNA載量、凝血酶原時(shí)間（PT）、乳酸脫氫酶（LDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.495、－0.440、－0.367、－0.280，均P＜0.05）；而與血小板（PLT）呈正相關(guān)（r＝0.335，P＝0.002）。SFTSV-RNA 載 量 與 PT、LDH、AST均呈正相關(guān)（r值分別為0.606、0.604、0.587，均 P＜0.001）；與 PLT 呈負(fù)相 關(guān) （r＝－0.384，P＜0.001）。見圖2。

圖2 N蛋白特異性IgM抗體滴度、SFTSV-RNA載量與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相關(guān)性Figure 2 Correlation of N protein specific IgM antibody titer，SFTSV-RNA load，and laboratory results

3 討論

抗體靶向治療是治療傳染病的一種有效可行的方法，其用于呼吸道合胞病毒和埃博拉病毒感染的治療均已取得了一定成果。近些年，已經(jīng)通過誘導(dǎo)中和抗體獲取流感病毒疫苗［9］。目前，SFTS尚無特效療法，主要以支持治療為主，本病相關(guān)的診治研究相對較少［10］。SFTS患者預(yù)后較差，約有12.7%～20.6%患者出現(xiàn)死亡［11－13］，因此，急需更多研究分析SFTS特異性抗體在發(fā)病過程中的作用。

近年來，有研究［7－8］發(fā)現(xiàn) SFTSV RNA 基因編碼7種蛋白質(zhì)，其中有3種重要的抗原蛋白，即N蛋白、Gn和Gc糖蛋白。Gn和Gc糖蛋白由M片段編碼的前體蛋白切割產(chǎn)生，其主要作用是負(fù)責(zé)受體結(jié)合和膜融合以介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，而N蛋白主要集中在診斷及檢測SFTS方面。

本研究發(fā)現(xiàn)，在急性感染階段SFTSV特異性體液應(yīng)答在急性感染期主要是N蛋白特異性抗體應(yīng)答，而只有少數(shù)患者具有Gn或Gc低滴度特異性抗體應(yīng)答。本研究中近50%患者N蛋白特異性IgM抗體出現(xiàn)中位時(shí)間為發(fā)病第10天，與其他研究［14］基本一致。在裂谷熱病毒（RVFV）或托斯卡納病毒感染患者中，N蛋白是急性感染期和恢復(fù)期期間負(fù)責(zé)產(chǎn)生IgM 和IgG 的主要抗原［7，15－17］。

本研究還發(fā)現(xiàn)N蛋白特異性IgM抗體可能直接或間接地起到減輕SFTS疾病嚴(yán)重程度的作用。首先，研究發(fā)現(xiàn)在急性感染階段缺乏N蛋白特異性IgM抗體的患者SFTSV-RNA載量較高，且病情較為嚴(yán)重。與無N蛋白特異性IgM抗體應(yīng)答的患者相比，誘導(dǎo)IgM抗體應(yīng)答的患者疾病進(jìn)展相對較輕。重要的是，N蛋白特異性IgM抗體應(yīng)答的水平也與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果改變相關(guān)。隨著N蛋白特異性IgM應(yīng)答的出現(xiàn)，SFTSV-RNA得到快速清除，患者凝血功能、肝功能、心肌功能得到恢復(fù)，且N蛋白特異性IgM抗體應(yīng)答較早的患者恢復(fù)相對較快。

本研究發(fā)現(xiàn)輕癥患者在住院期間均出現(xiàn)N蛋白特異性IgM應(yīng)答，且出現(xiàn)應(yīng)答時(shí)間較早、滴度較高；而重癥患者出現(xiàn)N蛋白特異性IgM應(yīng)答較晚、滴度較低；因此，N蛋白特異性IgM抗體滴度定量檢測有助于臨床醫(yī)生評估病毒清除率和患者臨床預(yù)后。對于無N蛋白特異性IgM抗體應(yīng)答或具有低水平IgM抗體滴度的SFTS患者需要重視并給予積極有效的治療策略。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SFTS患者病情嚴(yán)重程度與N蛋白特異性IgM抗體水平相關(guān)，且IgM抗體產(chǎn)生可能是病情得到較快緩解的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)高滴度N蛋白特異性IgM抗體的出現(xiàn)有利于改善SFTS疾病的病情，有利于SFTSV的清除，并有助于凝血功能、肝功能、心肌功能的恢復(fù)。SFTS患者可以常規(guī)進(jìn)行N蛋白特異性IgM抗體滴度的檢測，可能有助于預(yù)測SFTS患者的臨床預(yù)后。此外，N蛋白特異性IgM抗體可能可作為治療重癥SFTS患者的方法，從而降低病死率。本文的局限性主要是本研究為單中心研究，且納入患者人數(shù)少；但N蛋白特異性IgM抗體是否可以預(yù)測患者死亡，可以通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。