郭海 王海彬 茍凌云 周馳 覃智斌 鐘偉華 王粵淇 朱永林 鄧章榮 朱勇 霍少川

1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科/廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545000 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東 廣州 510405 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 5.桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂林 541000 6.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510405

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一種全身性骨代謝疾病，其特征在于絕經(jīng)后進(jìn)行性的骨量減少和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)退變[1]。女性絕經(jīng)后引起的雌激素缺乏會(huì)增加骨吸收并加速骨質(zhì)流失。目前臨床上常用的激素替代療法如福善美、福美加等西醫(yī)藥物治療，在改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松方面雖起到一定療效，見(jiàn)效快，但副作用不能忽視。因此，尋找一種對(duì)于PMOP療效確切、安全性高的藥物是業(yè)內(nèi)面臨的重要挑戰(zhàn)。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)“腎主骨”，“脾主肌肉”及“氣血不通則痛”，骨質(zhì)疏松癥治療當(dāng)以補(bǔ)腎益精、活血祛瘀為法。仙靈骨葆膠囊含有淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂等成分，是一種以中醫(yī)藥理論為依據(jù)制成的既能預(yù)防又能治療的中成藥，兼補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、化瘀血之功效，在PMOP治療中具有良好的臨床療效[2]。實(shí)驗(yàn)研究已證明仙靈骨葆膠囊能夠提高大鼠的骨量，但其是否通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制發(fā)揮作用目前并不清楚。組蛋白去甲基化酶JMJD2B表達(dá)水平與骨密度呈正相關(guān)性，可作為PMOP的一種預(yù)測(cè)指標(biāo)[3]。本研究在此基礎(chǔ)上采用去勢(shì)大鼠模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，給予仙靈骨葆膠囊和福美加藥物干預(yù)，觀察仙靈骨葆膠囊對(duì)去勢(shì)大鼠的干預(yù)療效，探討其防治骨質(zhì)疏松的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40只6月齡雌性SD大鼠(SPF級(jí))，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)并飼養(yǎng)，遵循動(dòng)物倫理，大鼠許可證號(hào)為：SYXK(粵)2013-0001，平均質(zhì)量：(447.24±59.57) g。所有大鼠生長(zhǎng)環(huán)境一致，濕度恒定(約50%)，室溫穩(wěn)定(維持23～25 ℃之間)，飼料、飲水等均統(tǒng)一配備，保持室內(nèi)良好通風(fēng)，大鼠入室1周內(nèi)為適應(yīng)喂養(yǎng)，隨后建立骨質(zhì)疏松模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

仙靈骨葆膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337)。福美加(杭州默沙東制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085)。

1.3 主要儀器和試劑

1.3.1儀器：本實(shí)驗(yàn)所需儀器主要包括由Bio-Rad公司提供的熒光定量PCR儀器、電泳儀、逆轉(zhuǎn)錄儀、全能型凝膠成像系統(tǒng)；Thermo公司提供的多功能酶標(biāo)儀；Eppendorf公司提供的離心機(jī)；海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司提供的脫色搖床；以及灰度分析軟件。

1.3.2試劑：本實(shí)驗(yàn)所需試劑主要包括由Genecopies公司提供的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，DBI公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。引物設(shè)計(jì)為：ERα：上游：5’-TGCAGGGAGAAGAGTTTGTG-3’，下游：5’-GAGACTTCAAGGTGCTGGATGA-3’；MJD2B：上游：5’-GGGAACAACCTCCTTCTCTAAG-3’，下游：5’-CTCCTGCTTGACCACAGATAG-3’；Runx2：上游：5’-CCTTGCTCTCTGTTCCTTCTC-3’，下游：5’- AGGTTGGAGGCACACATAAG -3’；ALP：上游：5’-CATGTTCCTGGGAGATGGTATG-3’，下游：5’-GTGTTGTACGTCTTGGAGAGAG-3’，由廣州四和生物科技有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與造模：根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為4組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組。造模方法：根據(jù)大鼠體重以0.35 mL/100 g比例腹腔注射一定體積10%水合氯醛水溶液麻醉，空白對(duì)照組中的SD大鼠保留雙側(cè)卵巢，僅切除卵巢旁部分脂肪；另外3組SD大鼠經(jīng)手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，制備骨質(zhì)疏松模型。造模后置于鼠籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素鈉(國(guó)號(hào)準(zhǔn)字：H11020456)肌肉注射(5萬(wàn)U/d)，預(yù)防感染。飼養(yǎng)1周。

1.4.2藥物干預(yù)：造模1周后，按照人與大鼠體表面積比折算成大鼠等效劑量，實(shí)驗(yàn)組按30.85 mg/100 g比例給予一定量仙靈骨葆膠囊，每天給藥1次；陽(yáng)性對(duì)照組按11.7 mg/100 g比例給予一定量福美加，每周給藥1次；空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組給予同體積蒸餾水，每天1次。時(shí)間均為3個(gè)月。

1.4.3指標(biāo)檢測(cè)：干預(yù)3個(gè)月后，處死各組大鼠，取右側(cè)股骨置于液氮中暫時(shí)保存。PCR定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，將50 mg股骨組織研成粉末狀后置入EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol Reagent進(jìn)行冰浴，并持續(xù)勻漿30 min，取勻漿后上清液至新EP管內(nèi)，12 000 r/min轉(zhuǎn)數(shù)離心，時(shí)間為15 min，取上清液備用。根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。通過(guò)RT-PCT檢測(cè)ERα、JMJD2B、Runx2和ALP mRNA 表達(dá)；在裝有50 mg股骨組織的EP管內(nèi)加入約10倍股骨組織體積RIPA裂解液，進(jìn)行勻漿處理，獲取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)指示，對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量，包括上樣、電泳與轉(zhuǎn)膜，孵育一抗、二抗。采用ChemiDocMP型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)表示ERα、JMJD2B相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 股骨組織ERα、JMJD2B表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表達(dá)量明顯下降，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表達(dá)量明顯上升，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表達(dá)量明顯上升，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1～4。

表1 各組大鼠ERα、JMJD2B表達(dá)量 Table 1 Expression of ERα and JMJD2B in each group pg / mL)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

2.2 成骨相關(guān)基因Runx2、ALP表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Runx2、ALP表達(dá)量明顯下降，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的Runx2、ALP表達(dá)量明顯上升，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的Runx2表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖5～6。

圖2各組ERα mRNA表達(dá)水平Fig.2 ERα mRNA expression levels in each group

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

圖3 各組JMJD2B的表達(dá)水平Fig.3 JMJD2B expression levels in each group

圖4 各組JMJD2B mRNA的表達(dá)水平Fig.4 JMJD2B mRNA expression levels in each group

組別Runx2ALP空白對(duì)照組1.62±0.111.57±0.37陰性對(duì)照組0.15±0.020.24±0.03實(shí)驗(yàn)組0.88±0.06*#△0.94±0.30*#陽(yáng)性對(duì)照組1.21±0.021.01±0.18F值/P值280.553/0.00013.306/0.002

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

圖5 各組Runx2表達(dá)水平Fig.5 Runx2 expression levels in each group

圖6各組ALP表達(dá)水平Fig.6 ALP expression levels in each group

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松是由于骨量下降、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)骨折，屬全身骨代謝疾病[4]。PMOP作為骨質(zhì)疏松癥的常見(jiàn)類型，多發(fā)生于女性絕經(jīng)后5～10年，在全世界范圍內(nèi)給大約超過(guò)50%的絕經(jīng)后老年女性的生活與健康帶來(lái)極大影響[5]。絕經(jīng)后婦女雌激素水平迅速下降，ER相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降，導(dǎo)致骨形成與骨吸收平衡失調(diào)，骨吸收程度大于骨形成，造成骨量丟失[6]，這提示ER與PMOP密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[7]ER基因啟動(dòng)子可能通過(guò)甲基化而抑制蛋白表達(dá)，影響骨形成與成骨分化。本實(shí)驗(yàn)采用去勢(shì)大鼠模擬絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素缺乏狀態(tài)，從表觀遺傳學(xué)角度闡釋仙靈骨葆膠囊防治骨質(zhì)疏松可能作用途徑。

組蛋白去甲基化酶JMJD2B可作為ER的共同激活因子，其表達(dá)水平受雌激素與ER調(diào)控[8]，可見(jiàn)，JMJD2B在骨代謝方面可能與雌激素-ER信號(hào)通路存在一定關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢摘除后股骨組織中JMJD2B、ERα表達(dá)量明顯下降。經(jīng)仙靈骨葆膠囊與福美加干預(yù)，去勢(shì)大鼠股骨組織JMJD2B、ERα表達(dá)水平均明顯上升。與前期研究一致，仙靈骨葆膠囊能夠提高JMJD2B、ERαmRNA及蛋白表達(dá)量。

王培霞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，仙靈骨葆膠囊能明顯提高去勢(shì)小鼠骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，減少骨質(zhì)破壞，提高骨質(zhì)生物力學(xué)參數(shù)。Runx2基因表達(dá)能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖及分化，增強(qiáng)骨再生[10]。ALP由成骨細(xì)胞分泌，是成骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物[11]。兩者均是骨生長(zhǎng)的相關(guān)基因，可作為評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的療效指標(biāo)。本研究結(jié)果提示仙靈骨葆膠囊與福美加均能顯著提高去勢(shì)大鼠股骨組織的Runx2、ALP表達(dá)水平，且仙靈骨葆膠囊較福美加提高幅度更大。

綜上所述，本研究得出結(jié)論，去勢(shì)大鼠股骨組織中ERα、Runx2、JMJD2B、ALP表達(dá)量降低，仙靈骨葆膠囊能提高其表達(dá)水平。