翁文玉 郝燁華 張瑜生 周志昆

廣東醫(yī)科大學藥學院，廣東 東莞 523808

骨質疏松(osteoporosis,OP)是老年人和絕經后女性中常發(fā)生的全身性代謝性骨病，以骨量減少、骨微結構遭到損壞，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征[1]。隨著人口老齡化的增加，OP已成為一個日趨嚴重的公共健康問題，給許多國家?guī)砹顺林氐慕洕摀鶾2]。截至2017年，中國60歲及以上人口達到2.41億人，占總人口的17.3%[3]。在美國和歐洲，有30%的女性患有骨質疏松癥，40%的絕經后婦女和30%的男性經歷過骨質疏松性骨折[4]。因此，如何有效地預防和治療骨質疏松已成為現代醫(yī)學研究的迫切問題。

有研究表明骨量的保持不僅取決于破骨細胞的吸收功能和成骨細胞(osteoblast，OB)的成骨功能，還取決于成骨細胞和破骨細胞的產生率和凋亡率的差異[5]，成骨細胞和破骨細胞的異常凋亡被認為是骨質疏松發(fā)病的重要致病機制，其中，成骨細胞凋亡的增加和成骨細胞數量的下降被認為是引起骨量丟失的關鍵發(fā)病機制[5]，因此，預防成骨細胞的凋亡也將成為治療骨質疏松的有效策略。

目前，細胞凋亡的途徑主要有三條：線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑，其中，線粒體途徑是主要的凋亡途徑[6]。 線粒體介導的凋亡信號通路的激活誘導OB凋亡，促進骨質疏松癥的發(fā)生[7]。因此，探索OB經線粒體途徑凋亡的分子機制，對于研究OP的發(fā)病機制，以及預防和治療OP具有重要意義。近年研究表明，成骨細胞經線粒體途徑凋亡的相關信號通路有：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3k)/Akt、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ca2+/CaM和其他信號通路等。

本文通過綜述線粒體途徑相關信號通路和因子對OB凋亡的作用，來為進一步研究安全、有效的抗骨質疏松藥物提供依據和新的作用靶點。

1 線粒體途徑介導的成骨細胞凋亡

線粒體既是細胞生命活動的控制中心，也是細胞凋亡的中心[8]。線粒體跨膜電位 ΔΨm的下降是線粒體介導的細胞凋亡的第一步[7]。眾多凋亡誘導因素導致線粒體通透性轉運孔(MPT)破壞或開放，ΔΨm下降，線粒體通透性增強，促進了細胞色素C(Cyt C)和細胞凋亡誘導因子(AIF)從線粒體中釋放，從而激活線粒體的半胱天冬酶(caspase)依賴性和非依賴性凋亡途徑[7,9]。釋放到細胞質中的Cyt C特異性地結合接頭蛋白Apaf-1，同時直接募集大量caspase 9并使之活化，進而誘導caspase級聯(lián)反應，激活 caspase 3，切割聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP，一種DNA修復酶)，引發(fā)不可逆的caspase依賴性細胞凋亡[7]。釋放到細胞質中的AIF 聚集，易位到細胞核，引起DNA斷裂，從而激活了線粒體caspase非依賴性凋亡途徑[9]。

在線粒體途徑介導的凋亡過程中，Bcl-2 蛋白家族的活性與其密切相關。 Bcl-2蛋白家族位于線粒體外膜上，根據其功能和結構上不同分為三個亞家族：①促凋亡BH3唯一蛋白(Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk、NOXA、PUMA等)，②抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Mcl-1、BFL-1/A1)，③促凋亡效應分子(Bax、Bak、Bok)[10]。眾多研究表明，線粒體內Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的增加會抑制成骨細胞凋亡，而Bad、Bax、Bak、Bim等蛋白表達的增加則會促進成骨細胞的凋亡[7,11-12]。Jilka等[5]敲除大鼠的Bak和Bax基因進行研究，結果顯示，Bak和Bax基因缺乏的大鼠中成骨細胞凋亡的數量顯著減少。

線粒體是活性氧(ROS)的重要來源，如：超氧化物(O2-)和過氧化氫(H2O2)，而過量的ROS會誘導氧化應激反應，破壞線粒體的呼吸鏈，引起線粒體功能障礙[13]。過量ROS可以激活Bid，改變線粒體膜通透性，促使Cyt C釋放，引起細胞凋亡[14]?？梢姡^量ROS引起的氧化應激會引起依賴于線粒體的細胞凋亡。

2 線粒體途徑相關信號通路對成骨細胞凋亡的作用

2.1 PI3k/Akt信號通路與成骨細胞凋亡

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是一種具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶雙重活性的脂類激酶，由調節(jié)性p85亞基和催化性p110亞基組成[15]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt又稱為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，擁有一個PH域。當生長因子和細胞因子等一系列細胞外信號與受體酪氨酸激酶(RTK)和G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)結合時，酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，PI3K的p85亞基進入到質膜的內表面，催化細胞膜內層的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)被p110亞基磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3分別與Akt和三磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)的PH域結合，使 Akt的S124、T450位點磷酸化和使PDK1磷酸化，磷酸化的PDK1 和哺乳動物雷帕霉素目標復合物(mTORC2)再分別使Akt的T308、S473位點磷酸化，從而完全激活Akt[16]。激活后的Akt作用于下游因子，調節(jié)細胞生命活動。

當PI3k/Akt信號通路激活后，進而作用于線粒體途徑的Bcl-2蛋白，從而主導成骨細胞經線粒體途徑的凋亡。丹參素通過上調PI3k/Akt信號通路，減少了MC3T3-E1成骨細胞中促進凋亡的相關蛋白Bax、AIF、Cyt C的表達，從而抑制成骨細胞凋亡[17]。而PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002可以下調p-Bad的表達，上調Bad的表達，進而上調了Bax/Bcl-2(促進Bax表達，抑制Bcl-2表達)和caspase-3的表達，結果表明PI3K/Akt途徑的失活通過下調p-Bad來部分阻斷成骨細胞中的抗凋亡作用[18]。Bin等[19]研究也表明，流體切應力抗TNF-α導致的成骨細胞凋亡，激活 PI3k/Akt 信號通路，活化的Akt使FoxO3a磷酸化，降低Bim和caspase-3的表達。綜合這些研究表明，由PI3k激活的Akt，可以進一步通過抑制 Bad、Bim、Bax等促凋亡蛋白的表達，促進Bcl-2和Bcl-xL抗凋亡蛋白的表達，減少線粒體途徑Cyt C、AIF、caspase-9、 caspase-3等相關促凋亡分子的表達，抑制OB經線粒體途徑的凋亡。

此外，PI3k/Akt還可以與其他信號通路相互作用，可以進一步激活FoxO3a[19]、CREB[20]等多種轉錄因子，從而抵抗氧化應激所導致的線粒體功能障礙，抑制OB的凋亡。因此，PI3k/Akt信號通路是預防和治療骨質疏松的關鍵性靶點。

2.2 MAPK信號通路與成骨細胞凋亡

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是由MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK/MEK/MKK)和MAPK組成的三步連續(xù)磷酸化級聯(lián)，三者又分別含有不同的亞族， MAPKKK含有Raf亞族(B-Raf、A-Raf、Raf-1)、MEKK亞族(MEKK1-4)、 ASK1和MST，MAPKK含有MEK1/2、MKK3和MKK6，MAPK含有ERK1/2、ERK5、p38、JNK等亞族[15]。四種主要的MAPKs： JNK、ERK1/2、ERK5、和p38被各種生物和物理化學應激物激活后，在應激反應中起關鍵作用，包括細胞增殖、分化，細胞因子產生和細胞的生存、凋亡等[21]。

2.2.1MAPK/JNK信號通路與成骨細胞凋亡：MAPK/c-Jun N末端激酶(JNK)信號通路是由ASK1、MEKK1激活MKK4/7，進而激活JNK1/2/3,活化的JNK激活下游因子，引起一系列細胞生命活動[15]。眾多研究顯示，當MAPK/JNK信號通路被激活時，JNK的磷酸化狀態(tài)顯著增加，c-Jun的mRNA和蛋白表達均顯著上調，JNK進而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，而促進促凋亡蛋白(Bax，caspase9，caspase3和相關凋亡因子配體)的增加，從而調控OB凋亡[22]。Guo等[23]研究表明，脂多糖(LPS)通過激活JNK途徑，顯著提高了p-JNK的蛋白水平，降低了MC3T3-E1成骨細胞中Bcl-2的表達,上調了Bax和caspase-3的mRNA的表達，激活caspase-3的活性，誘導OB經線粒體途徑凋亡。JNK特異性抑制劑SP600125的預處理則可增強抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制 Bax從細胞質轉運到線粒體，阻斷線粒體中Cyt C的釋放和caspase-3的激活，抑制成骨細胞凋亡[24]?？梢?，MAPK/JNK信號通路促進OB經線粒體途徑凋亡，而阻斷該信號通路的傳導可以是一種抗OB凋亡的有效手段。

2.2.2MAPK/ERK1/2信號通路與成骨細胞凋亡：MAPK/細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)1/2信號通路由Raf同工酶B-Raf、A-Raf、Raf1激活MEK1/2，再進一步激活ERK1/2，進而作用于下游因子，調節(jié)細胞活動[15]。目前，有研究表明，MAPK/ERK1/2信號通路會抑制成骨細胞的凋亡。Chen等[25]研究表明，姜黃素通過激活ERK1/2通路，上調p-ERK1/2的表達，抑制由地塞米松(Dex)誘導的Bcl-2下調和Bax上調，從而抑制線粒體中Cyt C的釋放，抑制Caspase-3的激活和其導致的PARP的裂解，最終抑制細胞凋亡，保護OB免受Dex誘導的細胞凋亡。Zhu等[26]研究也表明，Vaspin促進ERK1/2磷酸化，上調Bcl-2的表達，下調Bax的表達，降低人成骨細胞的凋亡。而另一部分研究卻表明，ERK1/2信號通路會促進成骨細胞的凋亡。Nam等[27]研究表明，槲皮素通過激活ERK引起線粒體依賴性機制誘導成骨細胞凋亡,ERK1/2活化，促進Bax的表達，誘導細胞凋亡。Zhao等[28]研究也表明，鎘(Cd)可以誘導OB的凋亡，通過增加 ERK1/2的磷酸化，降低線粒體跨膜電位 ΔΨm，增強 caspase-3的活性，而ERK1/2抑制劑(U0126)則消除了Cd誘導的細胞凋亡。這些研究顯示，MAPK/ERK1/2信號通路參與了OB經線粒體途徑的凋亡，但其對于凋亡的具體作用存在一定爭議，其調控機制尚不十分明確。

2.2.3MAPK/ERK5信號通路與成骨細胞凋亡：MAPK/ 細胞外信號調節(jié)激酶5(ERK5，也稱為BMK1)信號通路由MEKK2/3激活MEK5，進而激活ERK5，活化的ERK5作用下游因子，也參與了抗凋亡的途徑[21]。Bin等[29]研究表明，流體剪切應力(FSS)通過激活ERK5信號通路阻斷TNF-α誘導的MC3T3-E1成骨細胞凋亡，活化的ERK5可以從細胞質穿梭至細胞核，導致Bad磷酸化,p-Bad被細胞質中的14-3-3蛋白質隔離，阻止其轉移至線粒體，抑制Bad，從而抑制其誘導的線粒體途徑caspase-3的活化。此外，Bin等[19]研究還發(fā)現，FSS通過激活p-ERK5，進一步激活p-Akt，活化FOXO3a，從而減少Bim的表達，抗TNF導致的OB凋亡。這些結果提示ERK5信號通路在FSS介導的成骨細胞抗凋亡作用中發(fā)揮重要作用。因此，ERK5信號通路可能成為抗骨質疏松癥新藥的一個治療靶點。

2.2.4MAPK/p38信號通路與成骨細胞凋亡：MAPK/p38信號通路由ASK1、TAK1激活MKK3/6，再進一步激活p38[15]。Yang等[30]研究表明，白介素(IL-1α)可以增加p38-MAPK的磷酸化，下調MC3T3-E1細胞中Bcl-2的表達，而顯著上調Bax和caspase-3的mRNA表達和蛋白水平，促進OB經線粒體途徑的凋亡。Guo等[31]研究表明，用槲皮素預處理下調p-p38MAPK蛋白的表達，則顯著恢復了Bcl-2和Bcl-xL的下降表達，降低了Bax的表達，從而抑制了Cyt C和caspase-3的表達，抑制LPS誘導的OB經線粒體凋亡途徑的凋亡?？梢?，這些藥物或因子通過激活或抑制MAPK/p38信號通路，進而影響B(tài)cl-2家族蛋白的活性，發(fā)揮著促進或抑制OB經線粒體途徑的凋亡的作用。

2.3 Ca2+/ CaM信號通路與成骨細胞凋亡

Ca2+/ CaM信號通路的激活是由細胞外信號與受體結合，激活GPCRs，進而激活磷脂酶C(PLC)，活化的PLC使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)分解為DAG和三磷酸肌醇(IP3)，后者作用于內質網IP3受體，使內質網中的Ca2+釋放，胞液中Ca2+濃度增加，激活鈣調蛋白(CaM)形成Ca2+/CaM復合物，進而使鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaM-PK)磷酸化，作用于下游因子，引起生理效應。

Ha等[32]研究表明，Cd激活Ca2+/CaM信號通路，破壞細胞內Ca2+濃度的平衡，使Ca2+增加，促進Ca2+/CaM復合物的形成，Ca2+/CaM復合物激活三個效應蛋白：鈣調蛋白依賴性磷酸二酯酶(CaM-PDE)、鈣調蛋白依賴性激酶激酶(CAMKK)和鈣調蛋白依賴性激酶II(CAMKII)。其中，活化的PDE激活ERK，誘導OB凋亡，而活化的CAMKK，則抑制ERK，抑制OB凋亡。另有研究表明，AlCl3使細胞內Ca2+增加，促進Ca2+/ CaM復合物的形成，進而使CaMKII磷酸化，活化的p-CaMKII誘導氧化應激，破壞線粒體呼吸鏈，引起OB凋亡[33]。可見，Ca2+/ CaM信號通路會與ERK交互作用來發(fā)揮對OB的抗凋亡或促凋亡作用。

2.4 其他信號通路和因子與成骨細胞凋亡

2.4.1Keap1/Nrf2信號通路：Keap1-Nrf2信號通路在保護細胞免受氧化應激損害方面發(fā)揮著重要作用[34]。Liu等[35]的研究表明，SFP激活Keap1-Nrf2信號通路，促進其下游因子HO1和NQO1增加，從而減弱Dex誘導的caspase活化、PARP切割，即通過調節(jié)Nrf2途徑來抑制Dex誘導ROS過量產生的OB凋亡。

圖1 OB經線粒體途徑凋亡及其相關的各信號通路和因子的作用示意圖。Fig.1 The schematic diagram of the apoptosis of OB by mitochondrial pathway and the effects of its related signaling pathways and factors

2.4.2PHB：抗增值蛋白(PHB，包括PHB1和PHB2)是位于線粒體內膜一種蛋白質，與氧化應激的產生有關，PHB 1與PHB 2的相互作用對呼吸鏈和線粒體膜通透性的穩(wěn)定起著重要作用[36]。Sripathi等[37]研究發(fā)現，敲除PHB基因，可以上調促凋亡因子(BAK和caspases)的表達，下調抗凋亡分子Bcl-xL的表達。而PHB的過表達卻會下調Bcl-2的表達，引起凋亡[38]。同時，PHB還與多條信號通路有關，如Akt2、CaMK可以激活PHB，而PHB則可以作用于PI3K/Akt、Raf/MEK/ERK信號通路、CytC和Bcl-2等[36]。此外，抗骨質疏松藥物黃芪三仙湯和艾香湯劑均能引起OB中PHB表達的明顯差異[39-40]。這些研究表明PHB參與了抑制或促進線粒體途徑凋亡的過程，PHB可以作為研究抗骨質疏松藥物的一個新靶點。

2.4.3Fox O家族：Fox O家族是一個重要的轉錄調節(jié)器，與多種功能細胞的關鍵蛋白質有關，主要包括四個成員：Fox O1、Fox O3a、Fox O4和Fox O6[41]。其中，Fox O3a與細胞凋亡密切相關，Fox O3a由Akt直接激活[41]。流體切應力抗TNF-α誘導的OB凋亡，激活PI3k/Akt信號通路，Akt1使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a抑制Bim的表達，減少caspase-3，從而抵御氧化應激，抗OB凋亡[19]。

2.4.4cAMP/CREB：cAMP/CREB轉錄因子的Ser133位點能夠被Akt/PKB磷酸化，p-CREB促進Bcl-2、Mcl-1的表達[42]，抑制抗霉素A(AMA)誘導的線粒體功能障礙，從而阻止OB凋亡[20]。

3 結語

綜上所述，線粒體途徑相關的眾多信號通路與因子對OB的凋亡發(fā)揮著促進或抑制的作用(如圖1所示)。其中PI3k/Akt、MAPK/ERK5信號通路的激活，MAPK/JNK、MAPK/p38等信號通路的抑制，是抑制OB凋亡，防治骨質疏松的關鍵，因此，Akt、ERK、JNK、p38、Ca2+、PHB、FoxO3a、CREB、Keap1/Nrf2等因子可以作為研究抗骨質疏松藥物的關鍵作用靶點。