林泳欣，王昌俊

1廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510000；2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，目前對于肝癌的治療以手術(shù)為主，但術(shù)后5年復發(fā)率高達70%。健脾化瘀方是導師根據(jù)“脾氣虧虛，瘀血內(nèi)結(jié)”理論結(jié)合名老中醫(yī)錢伯文教授的臨床經(jīng)驗總結(jié)而成，具有健脾益胃、化瘀散結(jié)等功效［1］。長期臨床實踐和實驗研究［2-7］證明健脾化瘀方對肝癌有著良好的治療效果。本研究主要觀察健脾化瘀方對HepG-2細胞的侵襲力、轉(zhuǎn)移和凋亡的干預作用，為健脾化瘀方治療肝癌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人源肝癌細胞株HepG-2由廣州中醫(yī)藥大學熱帶病研究所惠贈。

1.2 實驗藥物 健脾化瘀方(莪術(shù)12g，白術(shù)20g，茯苓20 g，苦參12 g，佛手12 g，白花蛇舌草15 g)購于廣東省人民醫(yī)院。

1.3 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰酶均購于Gibco公司(美國)；青霉素G和鏈霉素、二甲基亞砜購于Sigma公司(美國)；CCK-8試劑盒購于jindo公司(日本)；TritonX-100購于Sanland化學公司；蘇木素、伊紅染液購于廣州維伯鑫科技有限公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4.2 藥物提取與配制 用電熱套加熱回流提取法，按比例取生藥910 g，加入10倍純凈水中浸泡 30分鐘后，90～100℃提取 3次，1.5 h/次，冷凝管可回收莪術(shù)、白術(shù)、佛手揮發(fā)油。合并提取液，紗布過濾，合并2次濾液，混勻水溶性提取液與揮發(fā)油，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃濃縮至90 mL浸膏，再稀釋成不同濃度的藥液，存放于4℃冰箱中，抑菌備用。按《藥理實驗方法學》中人(70 kg)與小鼠(0.020 kg)體表面積折算等效劑量比值為0.0026，換算后確定健脾化瘀方低、中、高劑量分別為6.24、12.48、24.96 g/kg。

1.4.3 CCK-8檢測細胞增殖 健脾化瘀方的工作濃度為16 mg/mL。將生長至80%～90%的HepG-2細胞用胰酶消化，離心后落板，每孔加細胞懸浮液100 μL，邊緣空加 100 μL的 PBS避免邊緣效應。24小時后用含不同濃度的含藥培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，每個濃度平行設置3個復孔，留3個孔不加細胞懸液做空白對照，3個孔加細胞懸液不加藥物做陰性對照。接著將培養(yǎng)細胞放入培養(yǎng)箱孵育48、72小時。將96孔板取出，用新鮮培養(yǎng)基更換所有舊培養(yǎng)基，每孔加10 μL的CCK-8。再將96孔板孵育2小時在450 nm的熒光下讀取OD(optical density)值。該實驗平行重復3次，得平均值用于實驗結(jié)果統(tǒng)計。

1.4.4 細胞遷移實驗(Transwell) 1)待對數(shù)生長期的HepG-2細胞長滿瓶底80%后換無血清DMEM培養(yǎng)液饑餓8小時。2)調(diào)整HepG-2細胞密度為3.0×105個/mL，將transwell小室放入24孔板中，在transwell上室內(nèi)加入50 μL細胞懸液，用無血清培養(yǎng)液配制對應健脾化瘀方藥物組(按照CCK-8算出的IC50濃度)濃度藥物，每上室分別加入50 μL含相同藥物濃度培養(yǎng)液，每組設5個復孔，在transwell下室加入含30%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液各 600 μL，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。3)將transwell小室取出，用棉棒將膜上表面未遷移的細胞小心擦去，下表面用10%甲醛固定30分鐘，PBS漂洗后蘇木素染色20分鐘，PBS漂洗至無色。4)在倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。

1.4.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 1)取對數(shù)生長期HepG-2細胞離心，調(diào)整細胞數(shù)為每毫升2×106個，將細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL。實驗分為：陰性對照組、健脾化瘀方藥物組。按實驗分組加入5 mL相應濃度的藥物工作液(健脾化瘀方藥物組濃度按照CCK-8計算得出的IC50濃度為準)，混勻后置37℃5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72小時后，收集細胞，1 000 rpm/min，離心5分鐘，棄上清，4℃PBS洗2次，再加入250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106個/mL。2)將細胞培養(yǎng)液吸至合適的離心管中，PBS洗滌貼壁細胞1次，膜酶消化細胞(胰酶不含EGTA)，加入吸出的DMEM培養(yǎng)基中止消化。吹打下所有的貼壁細胞，吹散，收集至離心管。1 000 rpm離心5分鐘。3)吸除上清，加入PBS重懸，再次l OOO rpm離心5分鐘。4)棄上清，加1 mL冰浴預冷70%乙醇，吹打混勻，4℃固定2小時，l 000 rpm離心5分鐘。加1 mLPBS，重懸細胞，再次離心，吸除上清。5)加入0.5 mL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，37℃避光溫浴30分鐘。6)進行流式細胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 12.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以(±s)表示，兩樣本均數(shù)間比較采用獨立分組t檢驗，多組之間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾化瘀方對細胞增殖的影響 不同濃度的健脾化瘀方作用于HepG-2細胞48、72小時后，根據(jù)回歸線性方程檢測，得出48小時藥物作用的IC50為12.15，72小時的IC50為9.75，且對于HepG-2細胞的抑制率差異具有統(tǒng)計學意義。根據(jù)預實驗結(jié)果，HepG-2細胞和LO2肝細胞在作用72小時的IC50(半抑制濃度)上更加接近，故可選擇健脾化瘀方作用72小時的IC50濃度作為后續(xù)實驗的藥物濃度，見表1。

表1 不同濃度健脾化瘀方作用48及72小時對細胞 HepG-2 增值的影響(±s，n=3)

表1 不同濃度健脾化瘀方作用48及72小時對細胞 HepG-2 增值的影響(±s，n=3)

注：對48小時與72小時2組不同藥物濃度，采用回歸線性方程檢驗，得出半數(shù)抑制濃度(IC50)

組別 48 h 72 h濃度20 0.9642±0.0297 0.9870±0.0272濃度15 0.9112±0.0328 0.7172±0.0493濃度10 0.4525±0.0935 0.4422±0.0369濃度8 0.2656±0.0253 0.2927±0.0054濃度5 0.1997±0.0840 0.2147±0.0501濃度2.5 0.0960±0.0259 0.1857±0.0315濃度0 0.0000 0.0000 R2 0.951 0.988 F 38.478 160.680 P 0.002 0.000 IC50 12.15 9.75

2.2 健脾化瘀方對HepG-2細胞遷移的抑制作用 藥物作用24小時后，在倒置顯微鏡下隨機選擇2個視野，進行拍照，并通過Image Pro Plus 6.0軟件計數(shù)。結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，健脾化瘀方藥物組遷移率降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖 1、表 2。

圖1 健脾化瘀方對HepG-2細胞遷移抑制作用(×10)

表2 健脾化瘀方對HepG-2細胞遷移的抑制作用

2.3 健脾化瘀方對HepG-2細胞凋亡的促進作用 與陰性對照組比較，健脾化瘀方有促進HepG-2細胞凋亡的作用，見圖2、表3。

圖2 健脾化瘀方對HepG-2細胞凋亡的流式細胞

表3 健脾化瘀方對HepG-2細胞凋亡的促進作用

3 討論

手術(shù)是肝癌的主要治療手段，根治性切除術(shù)后機體處于一種腫瘤休眠狀態(tài)，即體內(nèi)存在一些微量腫瘤細胞，在一定時間范圍內(nèi)沒有被消除而潛伏，隨著時間的推移及體內(nèi)外因素的刺激會促使腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移［8］，而肝癌的術(shù)后復發(fā)是導致患者死亡的最常見和最主要的原因，因此促進術(shù)后休眠，預防復發(fā)轉(zhuǎn)移對于肝癌的治療尤為重要。對于肝癌術(shù)后患者，針對體內(nèi)潛伏著的微量腫瘤細胞，如果能有效控制甚至消除殘存微量癌細胞，就能保持腫瘤處于休眠狀態(tài)，延長生存期。癌細胞對機體產(chǎn)生傷害離不開其自身的增殖、侵襲、遷移的能力，若能抑制癌細胞以上能力，能在一定程度上延緩腫瘤對機體的侵害。研究顯示健脾化瘀方中的白花蛇舌草能通過促進免疫因子的分泌增強免疫以消除腫瘤細胞［9］；莪術(shù)油能明顯抑制肝癌細胞增殖［10］；苦參能增強對肝癌細胞增殖的抑制，促肝癌細胞凋亡［11］；茯苓多糖能增強機體的免疫應答［12］等。本研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀方能有效抑制癌細胞的增殖和遷移，降低侵襲能力，并能促使癌細胞凋亡，提示健脾化瘀方能有效減緩肝癌術(shù)后腫瘤的復發(fā)，可能是通過對機體內(nèi)部殘存休眠腫瘤細胞的抑制增殖及遷移能力，促進殘存腫瘤細胞的凋亡，進而延緩腫瘤復發(fā)的進程，延長休眠期，保證了一定的生存時間。