冉廣宇

蘭州市第一人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050

白楊素是一種從紫葳科植物木蝴蝶中提取的黃酮類化合物［1-2］，具有低毒或無(wú)毒的特點(diǎn)，不僅具有常見(jiàn)的黃酮類結(jié)構(gòu)，而且在A環(huán)的5位和7位上有兩個(gè)羥基，使其具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤活性等。大量研究顯示［3-6］，對(duì)于許多腫瘤細(xì)胞，包括鼻咽癌、前列腺癌、單核白血病細(xì)胞等，白楊素均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)，但對(duì)于結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的作用如何尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在探討白楊素對(duì)體內(nèi)外結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，為結(jié)腸癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)BALB/c-裸鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6～8周齡，16～18 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2013-0014。白楊素(Sigma公司提供)；結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(上海細(xì)胞庫(kù)提供)；DMEM液體培養(yǎng)基(HyClone公司提供)；胎牛血清(Gibco/Invitrogen公司提供)；細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒(Cell counting Kit，CCK-8)；赫斯特染色(Hochest)33258染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)傳代(約3天傳代1次)。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞3遍，2 mL/次，以1 mL的0.25%胰蛋白酶溶液，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2分鐘，待貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形時(shí)棄胰酶。用2 mL培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。然后根據(jù)需要取合適細(xì)胞密度將細(xì)胞移入新培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于各實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的建立 取24只BALB/c-裸鼠，無(wú)菌條件下于小鼠背部皮下接種SW480細(xì)胞懸液，密度約7×106/只。待接種的腫瘤長(zhǎng)至100 mm3左右后認(rèn)為SW480結(jié)腸癌的裸鼠異種移植模型構(gòu)建完成。

1.2.3 分組給藥 將24只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。對(duì)照組腹腔注射二甲基亞砜(DMSO)0.1 mL/ 只；白楊素低(30 mg/kg)、中(60 mg/kg)、高(120 mg/kg)劑量組分別溶于0.1 mL DMSO中，均以腹腔注射方式給藥，隔日給藥1次，共10次。末次給藥48小時(shí)后，將4組荷瘤小鼠全部處死，取出體內(nèi)腫瘤并稱重。

抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%

1.2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480用胰酶消化后，離心并去除上清液。用DMEM培養(yǎng)基重新制成細(xì)胞懸液，稀釋細(xì)胞密度約至2×104個(gè)/mL，取100μL種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞懸液加入白楊素各組及 DMSO 組，使其終濃度為 20、40、80 μmol/L(μM)。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待24小時(shí)后，各孔加入CCK-8各10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度OD值：

細(xì)胞增殖抑制率(%)=［(對(duì)照組OD值-空白組OD值)/(白楊素各組OD值-空白組OD值)］×100%

1.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，用PBS洗3次，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，均勻平鋪于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞懸液加入白楊素各組(20、40、80 μM)及 DMSO 組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，加入EDTA-胰酶混合液消化5分鐘后，1 000 r/min離心10分鐘，使用Hoechst33258染液染色2分鐘后滴抗熒光淬滅液至載玻片上，將蓋玻片蓋至6孔板各孔中。熒光顯微鏡下(Nikon，400×)照相，使用Image-plus軟件分析結(jié)果，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率：

凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 10.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)的影響 用藥前，24只荷瘤裸鼠皮下腫瘤質(zhì)地較硬，體積約(100±10)mm3。用藥后，白楊素各劑量組裸鼠的活動(dòng)飲食與對(duì)照組無(wú)顯著不同，說(shuō)明劑量不影響裸鼠的正常生活質(zhì)量。白楊素低、中、高劑量組瘤塊重量均低于對(duì)照組(P＜0.05)，抑瘤率分別為 25.91%，39.98%和56.77%，且具有劑量依賴性，提示白楊素對(duì)SW480細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用，見(jiàn)表1。

2.2 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響 對(duì)照組SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)正常，經(jīng)20、40、80 μM的白楊素處理24小時(shí)后，SW480細(xì)胞生長(zhǎng)均不同程度減慢，增殖抑制率分別為10.10%、45.63%、61.96%，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞異種移植小鼠平均瘤重、抑瘤率和平均體質(zhì)量

表2 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響

2.3 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞的染色質(zhì)密度均勻一致，20、40、80 μM 白楊素干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞即發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變(P＜0.05)，細(xì)胞核縮小碎裂，碎裂后呈大小不等的不規(guī)則細(xì)胞碎片，且有不同程度的凋亡出現(xiàn)，80μM白楊素組的凋亡率高于20 μM及40 μM白楊素組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表3、圖1。

表3 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖1 白楊素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

黃酮類化合物是一種分布廣泛的植物色素，易于人體吸收，在各種食物中大量存在，目前已有超過(guò)3 000種的黃酮類化合物的生物活性被鑒定［7］。白楊素又稱白楊黃素，存在于紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮及松科植物山白松的心木，是常見(jiàn)的黃酮類化合物，其在淡黃色棱柱形結(jié)晶(由甲醇中結(jié)晶)的熔點(diǎn)為285℃，溶于氫氧化堿溶液，微溶于乙醚、乙醇和氯仿，不溶于水［8］。有研究［9］比較多種天然黃酮類及其衍生物，證實(shí)白楊素對(duì)許多種類的腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用，而在正常細(xì)胞中幾乎無(wú)毒。

腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是不受控制的生長(zhǎng)，相關(guān)研究［10-12］表明，作為一種天然的黃酮類化合物，白楊素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制活性作用。本研究發(fā)現(xiàn)白楊素可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)，增殖抑制率分別為 10.10%、45.63%、61.96%，且呈劑量依賴性。同時(shí)在白楊素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的凋亡試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)白楊素能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且各劑量組出現(xiàn)不同程度的凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、凋亡小體等現(xiàn)象。

腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)的結(jié)果，細(xì)胞凋亡在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能阻礙腫瘤的惡性增殖［13］。因此目前多數(shù)抗腫瘤治療以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主。已有研究［14］證實(shí)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是白楊素發(fā)揮抗腫瘤活性的主要機(jī)制之一。由此可推測(cè)白楊素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體內(nèi)生長(zhǎng)的抑制作用可能通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)。一些研究［15］表明，白楊素參與人類肝癌細(xì)胞HepG2及人類鼻咽癌細(xì)胞CNE-1凋亡的內(nèi)在途徑。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，把SW480細(xì)胞接種到裸鼠，采用不同濃度的白楊素進(jìn)行干預(yù)，能使移植瘤體積小于對(duì)照組，說(shuō)明白楊素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480具有體內(nèi)抑制生長(zhǎng)作用。表明白楊素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。這一結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致，如白楊素抑制胃癌、黑色素瘤細(xì)胞、肝癌的增殖均與其能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡受阻是腫瘤的重要發(fā)病機(jī)制之一。核轉(zhuǎn)錄因子 -кB(nuclear factor kappa B，NF-кB)是一類與凋亡相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-кB在多種腫瘤中高表達(dá)，抑制NF-кB的表達(dá)后可促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16-17］。此外，大量研究證實(shí)［18-20］，白楊素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括抑制PI3K/Akt等抗凋亡蛋白；抑制I-κB激酶活性；誘導(dǎo)Caspase-3活性增高和下游靶點(diǎn)蛋白水解；誘導(dǎo)激活促凋亡的Bax基因；降低抗凋亡的Bcl-2基因表達(dá)；改變基于谷胱甘肽的氧化還原系統(tǒng)以及抑制腫瘤新生血管形成等。因此下一步將研究白楊素是否能夠下調(diào)SW480細(xì)胞中NF-кB的表達(dá)，以及是否上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而最終誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡。

盡管多數(shù)研究表明，白楊素在不同腫瘤細(xì)胞系可誘導(dǎo)凋亡，但到目前為止，其誘導(dǎo)凋亡的確切機(jī)制仍不清楚。因此，要明確白楊素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的確切機(jī)制開(kāi)展進(jìn)一步研究十分必要。