王傳聰， 唐修陽， 項(xiàng) 杰， 歐江濤

(鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051)

羅氏沼蝦別稱馬來西亞大蝦，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬。原產(chǎn)于南亞、東南亞以及大洋洲北部等地區(qū)，生活在淡水或咸淡水水域，自然棲息于受潮汐影響的河口區(qū)，是一種較大型的熱帶經(jīng)濟(jì)蝦類[1]，具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分好以及養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，素有“淡水蝦王”之稱[2]。然而，隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，一些嚴(yán)重的疾病已在羅氏沼蝦中流行，包括由新型病原——螺原體引起的2010年羅氏沼蝦螺原體病，引發(fā)大規(guī)模的死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。這些水產(chǎn)動(dòng)物病害在帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益損失的同時(shí)，也嚴(yán)重制約了羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。因此，及時(shí)開展羅氏沼蝦的抗病研究是極為重要的。

微衛(wèi)星標(biāo)記是目前最常用的分子標(biāo)記之一。由于與其他分子標(biāo)記相比，它具有保守性高、多態(tài)性豐富、在基因組中分布廣泛等特點(diǎn)[3]，近年來，在動(dòng)物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析以及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前在水生動(dòng)物的相關(guān)研究中，研究者已經(jīng)對(duì)牙鲆、二長(zhǎng)棘鯛、興國(guó)紅鯉、中國(guó)明對(duì)蝦等品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并基于測(cè)序結(jié)果對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析[4-7]。因此，開展羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR)的研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出SSR位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行數(shù)量分析和多態(tài)性評(píng)價(jià)等，從而為羅氏沼蝦基因克隆、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析以及為羅氏沼蝦病害防治和選育種工作等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羅氏沼蝦：購于江蘇省南京市仙林農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，個(gè)體質(zhì)量在20～25 g，共計(jì)100尾，用PCR方法檢測(cè)螺原體，結(jié)果均呈陰性，在26～28 ℃水溫條件下養(yǎng)殖備用。螺原體MR-1008：分離于江蘇省高郵市自然發(fā)病的羅氏沼蝦，在R2液體培養(yǎng)基中于30 ℃孵育48 h，待其生長(zhǎng)到最具有侵染能力的對(duì)數(shù)期備用。

1.2 總RNA提取

采用TRIzol提取法提取羅氏沼蝦肝胰腺組織總RNA，提取產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的樣品保存在干冰中送往聯(lián)川生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 RNA測(cè)序及組裝

經(jīng)Illumina HiSeq2000/2500進(jìn)行測(cè)序，在健康羅氏沼蝦和螺原體感染羅氏沼蝦的肝胰腺組織中得到總mRNA原始數(shù)據(jù)(raw reads)分別為 53 070 612、61 244 504條，對(duì)raw reads進(jìn)行過濾得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)分別為 52 757 004、60 719 728條(表1)。將得到的有效數(shù)據(jù)使用Trinity軟件進(jìn)行拼接，最終得到33 450條Unigenes(總長(zhǎng)度 29 327.225 kb)對(duì)應(yīng)43 405個(gè)轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度在200～2 000 bp之間的超過85%，符合基因轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度規(guī)律(表2)。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

注：Q20和Q30分別代表堿基被測(cè)錯(cuò)的概率P為1%和1‰，其計(jì)算公式為Q= -10lgP。GC為G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比，用于檢測(cè)有無AT、GC分離現(xiàn)象。

1.4 SSR標(biāo)記篩選

SSR檢測(cè)是以組裝出來的Unigene作為參考序列，使用MISA軟件批量識(shí)別和定位所有SSR，然后對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)分析。

表2 拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)

注：N50表示將Unigenes從長(zhǎng)到短排序，依次累加Unigenes堿基數(shù)后，Unigenes總堿基數(shù)50%的Unigenes的長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)錄本同。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

對(duì)組裝所得的33 450條unigenes序列進(jìn)行比對(duì)篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 356個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在12 930條Unigenes上，發(fā)生頻率(含有SSR的Unigenes條數(shù)占總Unigenes條數(shù)的比例)為38.65%，其中10 504條Unigenes序列只含有單個(gè)SSR位點(diǎn)，2 426條Unigenes序列含有2個(gè)或2個(gè)以上的SSR位點(diǎn)。由表3可知，羅氏沼蝦的SSR序列平均距離為1.91 kb，總長(zhǎng)度為230 820 bp，平均長(zhǎng)度為15 bp。

羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中各種SSR出現(xiàn)頻率差異較大，各類型出現(xiàn)的頻率不同，主要為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)(圖1)。單核苷酸重復(fù)的SSR數(shù)量最多，其分布頻率為17.70%，占羅氏沼蝦總SSR的38.56%，其次為二核苷酸重復(fù)，其分布頻率為16.53%，占羅氏沼蝦總SSR的36.00%，三核苷酸重復(fù)的SSR分布頻率為10.71%，占羅氏沼蝦總SSR的23.32%。四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類型的SSR類型較少，分布頻率分別為0.53%、0.24%、0.21%，分別占羅氏沼蝦總SSR的1.15%、0.52%、0.45%。

表3 SSR在羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率

由表4可知，羅氏沼蝦SSR重復(fù)次數(shù)為5、6、7、12次的SSR位點(diǎn)較多，分別為2 245、4 540、1 647、1 796個(gè)，分別占羅氏沼蝦總SSR的14.62%、29.56%、10.73%、11.70%，其次為重復(fù)8、13、14次的SSR位點(diǎn)，分別為938、1 216、925個(gè)，分別占總SSR的6.11%、7.92%、6.02%，重復(fù)次數(shù)≥16次的SSR位點(diǎn)相對(duì)較少，總共為1 277個(gè)，占總SSR的8.32%。

2.2 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中SSR的特點(diǎn)

羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中共搜索到512種不同序列類型的SSR，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)序列類型分別有40、66、201、89、60、56種。單核苷酸中出現(xiàn)的重復(fù)類型多為A/T，分別占羅氏沼蝦總SSR的39.33%，C/G類型單核苷酸序列的SSR非常少。在二核苷酸重復(fù)中主要以GA/TC、AG/CT和AT/TA為主，分別為1 184、1 501、1 300個(gè)，分別占二核苷酸重復(fù)SSR的21.42%、27.15%、23.52%，分別占羅氏沼蝦總SSR的7.71%、9.77%、8.47%。三核苷酸重復(fù)在羅氏沼蝦總SSR中的占比較大，其重復(fù)類型見表5。各種三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)的數(shù)量差別較大，其中AAT/TTA出現(xiàn)的數(shù)量最多，為216個(gè)，出現(xiàn)頻率為0.65%，占羅氏沼蝦總SSR的1.41%；其次為AAG/TTC、ATT/TAA、CCT/GGA、CTC/GAG、CTT/GAA，分別為204、187、197、191、215個(gè)，分別占羅氏沼蝦總SSR的1.33%、1.22%、1.28%、1.24%、1.40%；其中CGG/GCC出現(xiàn)的數(shù)量最少，僅為8個(gè)，占羅氏沼蝦總SSR的0.05%。

2.3 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性評(píng)價(jià)

由圖2可知，羅氏沼蝦SSR重復(fù)長(zhǎng)度分布中重復(fù)長(zhǎng)度最小為12 bp，最大為25 bp，平均長(zhǎng)度為15 bp。其中重復(fù)長(zhǎng)度主要為12～16 bp及18 bp，占羅氏沼蝦總SSR的86.33%，其次是重復(fù)長(zhǎng)度為17 bp及20～22 bp，占羅氏沼蝦總SSR的11.91%，重復(fù)長(zhǎng)度在19 bp和≥23 bp的SSR位點(diǎn)數(shù)相對(duì)較少，分別僅占羅氏沼蝦總SSR的0.79%、0.96%。根據(jù)該結(jié)果，可推測(cè)該研究中Ⅱ型SSR(長(zhǎng)度為12～<20 bp)的比例為89.07%，具有中等多態(tài)性，有較高的潛在可用性。而具有高度多態(tài)性的Ⅰ型SSR(長(zhǎng)度≥20 bp)則較少。

2.4 含SSR位點(diǎn)Unigene的功能注釋

利用軟件對(duì)成功篩查到的SSR位點(diǎn)所在的12 930條Unigene序列進(jìn)行功能注釋。通過Blast比對(duì)，有410個(gè)Unigene被注釋到NCBI Nr數(shù)據(jù)庫的已知序列，并呈現(xiàn)較高的相似性和同源性，但有96.83%的Unigene未得到任何注釋。

表4 羅氏沼蝦SSR重復(fù)次數(shù)分布

將15 356條SSR位點(diǎn)所在的12 930條Unigene序列注釋到KOG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相關(guān)基因功能的預(yù)測(cè)和分類。結(jié)果顯示其中的275條Unigene(2.13%)能夠在KOG找到相應(yīng)的注釋信息，根據(jù)其功能可以被分為22類(圖3)，并對(duì)其進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。從分析結(jié)果可以看出，這275條被注釋的Unigene功能種類較為全面，涉及大多數(shù)的生命活動(dòng)過程或功能?！耙话愎δ茴A(yù)測(cè)”是最大的一個(gè)分類，包含57條Unigene。其次是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”“翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，分子伴侶”和“RNA加工和修飾”，分別包含34、26和19條Unigene。“核結(jié)構(gòu)”這個(gè)分類中包含的Unigene數(shù)最少，僅有1條。

3 討論

本研究通過IlluminaHiSeq2000/2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從大量組裝所得轉(zhuǎn)錄組Unigene序列中篩選獲得15 356個(gè)SSR位點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方式，此方法篩選效率較高，工作量相對(duì)較小，適合大范圍開拓SSR標(biāo)記位點(diǎn)[7]。

SSR在整個(gè)基因組的不同位點(diǎn)都有分布，多態(tài)信息含量(polymorphism information content，簡(jiǎn)稱PIC)起衡量基因位點(diǎn)多態(tài)性的作用，通常PIC能反映某個(gè)群體的遺傳變異程度、位點(diǎn)多樣性等[8]。另外SSR片段長(zhǎng)度也是判斷其多態(tài)性的重要依據(jù)[9]。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到的SSR中，重復(fù)序列長(zhǎng)度在12 bp以上的SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)占總SSR數(shù)的76.95%，多態(tài)性較豐富，基于該研究結(jié)果能夠進(jìn)行有針對(duì)性的引物設(shè)計(jì)。在數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建中，SSR多態(tài)性越高，所建立的圖譜越精密和精確，基因的定位越精準(zhǔn)[10-11]。

隨著微衛(wèi)星輔助育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用，通過遺傳操作培養(yǎng)出羅氏沼蝦抗病品種，是蝦病控制中一個(gè)值得選擇的方法。已有的研究表明，疾病發(fā)生時(shí)群體內(nèi)會(huì)有顯著的變異，通過微衛(wèi)星等標(biāo)記對(duì)發(fā)病動(dòng)物中死亡群體和存活群體的遺傳變異進(jìn)行研究，有望獲得與抗病性狀相連鎖的標(biāo)記，進(jìn)而對(duì)抗病基因進(jìn)行標(biāo)記和定位以培育出具有持久抗病能力的優(yōu)良品種[12]。

本研究對(duì)羅氏沼蝦SSR的分布特征進(jìn)行分析，不僅在RNA水平上體現(xiàn)了羅氏沼蝦SSR的分布特點(diǎn)和規(guī)律，而且也為開發(fā)羅氏沼蝦功能基因奠定了SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)，同時(shí)也為羅氏沼蝦QTL定位、基因克隆、遺傳結(jié)構(gòu)分析及其他遺傳學(xué)研究提供了有效的分子標(biāo)記。

表5 三核苷酸SSR不同重復(fù)單元的比例

注：頻率為含有SSR的Unigenes數(shù)與總Unigenes數(shù)之比；占比為該重復(fù)基元SSR占總SSR的比例。