吳曉毅 張可一 張 睿 王昌海

首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069

中藥雷公藤為雷公藤Tripterygium Wilfordii Hook.f.3～4年生根的去皮木質(zhì)部，臨床上可用于治療類風濕性關節(jié)炎、慢性腎病等自身免疫性疾病[1]，其所含的萜類成分是其發(fā)揮生物活性的物質(zhì)基礎[2]。隨著藥理研究深入，雷公藤甲素和雷公藤紅素等萜類成分還被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗腫瘤活性[3-5]。然而，受限于植物雷公藤生長周期長、萜類成分含量低及藥材資源單一等因素[6-7]，雷公藤萜類活性成分的供需關系嚴重失衡。因此，結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術，提取雷公藤萜類成分具有較高的現(xiàn)實意義，但目前少見雷公藤懸浮細胞萜類成分提取工藝的研究。本研究以二萜類成分雷公藤甲素和雷酚內(nèi)酯，以及三萜類成分雷公藤紅素含量的綜合評分為指標，采用正交試驗優(yōu)化雷公藤懸浮細胞總萜類物質(zhì)的提取工藝，以期得到簡單、經(jīng)濟、科學的提取工藝，為雷公藤萜類活性成分的獲取及后續(xù)研發(fā)提供實驗依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試劑

雷公藤懸浮細胞經(jīng)首都醫(yī)科大學中藥資源與分子生藥學實驗室建立培養(yǎng)體系及繼代培養(yǎng)；雷公藤甲素（成都PUSH生物科技公司，批號：T0120025）；雷酚內(nèi)酯（上海源葉生物科技有限公司，批號：P07S8F43375）；雷公藤紅素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14092610）；甲硝唑（中國食品藥品檢定研究院，批號：J7ZH-1VA9）作為內(nèi)標物質(zhì)。甲醇（Thermo Fisher Chemical，批號：C-18419，色譜純）；乙腈（Thermo Fisher Chemical，批號：L-17369，色譜純）；甲酸（天津市福晨化學試劑廠，批號：20150807，分析純）；娃哈哈純凈水（娃哈哈集團有限公司）。

Agilent 1290/6490液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；1-14型臺式離心機（Sigma 公司）；BSA32025 型（d=0.01 g）、BT25S 型（d=0.01 mg）電子天平（Sartorius公司）；KQ5200DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 萜類成分含量測定

2.1.1 超高液相-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS）條件 超高液相色譜條件：Waters HSS T3色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為 0.1%甲酸-水（A）-乙腈（B）梯度洗脫：0～2 min 60%A，2～10 min 60%→10%A，10～14 min 10%A，14～14.01 min 10%→60%A，14～16 min 60%A；柱溫30℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正負離子交替模式檢測；DMRM定量模式；雷公藤甲素 361.1→128.0（50 eV，定量），105.0（50 eV）；雷酚內(nèi)酯 313.0→225.0（23 eV，定量），183.0 （33 eV）；雷公藤紅素 451.1→215.0 （20 eV），201.0（26 eV，定量）；內(nèi)標物甲硝唑 172.0→127.9（15 eV，定量），82.0（15 eV）。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取 0.62、4.05、0.72、0.80 mg的雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯、雷公藤紅素和甲硝唑標準品，用色譜級甲醇定容至5 mL容量瓶中，依次得到濃度為 124.00、810.00、144.00、160.00 μg/mL的單一對照品儲備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液制備 取干燥雷公藤懸浮細胞0.1 g，精密稱定，按照正交設計試驗方案進行提取。對提取后的樣品進行補重，離心（12 000 r/min，2 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素單一對照品溶液適量，加甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為 4.96、32.40、5.76 μg/mL 的混合對照品儲備液，倍比稀釋，制成系列混合對照品溶液，并在每一混合對照品溶液中添加一定量的甲硝唑?qū)φ掌啡芤?，使甲硝唑?nèi)標物濃度均為1.60 μg/mL。按“2.1.1”項下方法進樣，以每個化合物的峰面積（Yi）與內(nèi)標峰面積（Ys）的比值（Yi/Ys）和對應化合物的濃度（X，μg/mL）作線性回歸，相關系數(shù)及線性范圍分別為：雷公藤甲素 y=0.0252x+2.02×10-4（r=0.9990，0.1984～4.9600 μg/mL）、雷酚內(nèi)酯 y=0.360x+0.840（r=0.9990，1.2960～32.4000 μg/mL）、雷公藤紅素 y=1.33x-0.0314（r=0.9966，0.2304～5.7600 μg/mL），結(jié)果表明該方法線性關系良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取同一批雷公藤懸浮細胞5份（每份0.1 g），每份加入30倍量80%甲醇，稱重，室溫浸漬12 h后，超聲提取0.5 h，補重，離心，取上清液過濾，過 0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項測定3個萜類成分及內(nèi)標物峰面積，根據(jù)標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的RSD依次為1.93%、3.01%和3.40%（n=5），表明方法重復性良好。

2.1.6 精密性試驗 取“2.1.5”項下的5號樣品作為供試品溶液，按“2.1.1”項連續(xù)進樣5次，記錄3個萜類成分及內(nèi)標物峰面積，根據(jù)標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的RSD值依次為2.04%、1.63%和2.36%（n=5），表明該儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.5”項下的5號樣品作為供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 按“2.1.1”項進樣測定，記錄3個萜類成分及內(nèi)標物峰面積，根據(jù)標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的 RSD 值依次為 1.66%、1.49%和 3.37%（n=6），表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 分別取0.05 g雷公藤懸浮細胞，共5份，每份精密加入0.5 mL混合對照品儲備液，樣品制備過程同前，分別按照“2.1.5”項和“2.1.1”項進行樣品制備和進樣測定。雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的平均回收率依次為97.07%、104.53%和 99.29%，RSD 值為 5.24%、2.14%和 4.96%（n=5），具體結(jié)果見表1，符合含量測定的要求。

2.2 提取方法的選擇

稱取雷公藤懸浮細胞3份，每份0.1 g。第1份樣品中加入20倍量80%甲醇室溫浸漬12 h；第2份樣品加入20倍量80%甲醇超聲提取1 h；第3份樣品加入20倍量80%甲醇室溫浸漬12 h后，超聲提取1 h。各樣品經(jīng)提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項進樣測定。采用外標法計算雷公藤甲素、雷公藤紅素及雷酚內(nèi)酯從雷公藤懸浮細胞中轉(zhuǎn)移出來的提取得率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與單獨使用室溫浸漬法和超聲處理法相比，室溫浸漬+超聲處理法可以獲得較多的雷公藤甲素、雷公藤紅素及雷酚內(nèi)酯。

表1 8個萜類成分的加樣回收率結(jié)果（n=5）

表2 不同提取方法對3種萜類成分的提取率（μg/g）

2.3 多指標綜合評分

2.3.1 AHP法計算權重 考慮到雷公藤甲素為雷公藤藥材和制劑中的常用質(zhì)控性成分[8-11]，雷公藤紅素為雷公藤中生物活性較強的代表性三萜類成分[12]，故從主觀上將3個指標劃分為：雷公藤甲素＞雷公藤紅素＞雷酚內(nèi)酯，運用一致性矩陣法構造判斷矩陣[13-15]，見表3。根據(jù)評判結(jié)果完成數(shù)據(jù)的歸一化處理，計算得到雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內(nèi)酯的權重系數(shù)分別為0.637、0.258和0.105。一致性比例因子CR=0.03＜0.10，表明此判斷矩陣具有滿意的一致性，權重系數(shù)有效[16]。

表3 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

2.3.2 計算多指標綜合評分 綜合評分=（雷公藤甲素含量/雷公藤甲素最大含量×0.637+雷公藤紅素含量/雷公藤紅素最大含量×0.258+雷酚內(nèi)酯含量/雷酚內(nèi)酯最大含量×0.105）×100。

2.4 單因素考察

2.4.1 甲醇濃度考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4份，分別加入30倍量30%、50%、80%和100%的甲醇溶液，稱重，室溫浸漬12 h后，超聲提取1 h，各樣品經(jīng)提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結(jié)果見圖1A。表明隨著甲醇濃度的增加，綜合評分升高，80%以后趨于平緩，考慮到提取成本，選擇甲醇濃度在30%～80%為宜。

2.4.2 提取時間考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4份，分別加入30倍量80%甲醇溶液，稱重，室溫浸漬 12 h 后，分別超聲提取 0.5、1、1.5、2 h 時樣品，各樣品經(jīng)提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結(jié)果見圖1B。表明隨著時間的延長，綜合評分略有提高，但變化不明顯，故為縮短提取時間并保證提取效率，控制提取時間在0.5～1.5 h為宜。

圖1 甲醇濃度、提取時間及溶劑用量對綜合評分結(jié)果的影響

2.4.3 溶劑用量考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4 份，分別加入 15、20、30、50 倍量 80%甲醇，稱重，室溫浸漬12 h，超聲提取1 h，各樣品經(jīng)提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結(jié)果見圖1C。表明當溶劑用量在30～50倍時，綜合評分趨于平緩，考慮到提取效率及經(jīng)濟成本，選擇溶劑用量為30～50倍為宜。

2.5 正交試驗設計

根據(jù)單因素考察試驗結(jié)果，考察可能影響提取效果的 3個因素：甲醇濃度（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C），按照 L9（34）表設計正交試驗，以 3 種指標的綜合評分為指標，試驗設計及結(jié)果見表4，方差分析見表5。由直觀分析可知，各因素對綜合評分的影響順序為C＞B＞A，最佳提取工藝為A2B1C3。方差分析表明因素C對提取效果有顯著性影響，因素A和B則無顯著性影響。綜合提取效率和工藝可行性，最佳提取工藝為：加入50倍量80%甲醇，浸漬12 h后，超聲提取0.5 h。

表4 提取工藝L9（34）正交設計試驗及結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

2.6 驗證試驗

精密稱量0.1 g雷公藤懸浮細胞，共3份，按照最佳工藝條件A2B1C3進行5次驗證試驗，結(jié)果雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內(nèi)酯的平均含量依次為（52.36±0.60）、（170.73±1.57）、（388.14±5.89） μg/g，且 RSD 值在2%以內(nèi)，綜合評分穩(wěn)定，見表6。表明該工藝的穩(wěn)定性好，具有一定的可行性，可供大規(guī)模提取應用。

表6 提取工藝驗證結(jié)果（μg/g）

3 討論

由于植物雷公藤生長周期較長，且所含的雷公藤甲素等萜類活性次生代謝產(chǎn)物含量較低，故為縮短實驗周期，提高實驗效率，擴大雷公藤中活性次生代謝產(chǎn)物的藥用來源，發(fā)展與雷公藤懸浮細胞相關的提取、鑒定和定量技術勢在必行。因此，優(yōu)化雷公藤懸浮細胞萜類成分提取工藝具有一定的現(xiàn)實意義和應用前景。本研究通過多指標綜合評分法和正交設計優(yōu)化得到雷公藤懸浮細胞總萜類物質(zhì)的最佳提取工藝為：加入50倍量80%甲醇，浸漬12 h后，超聲提取0.5 h。

在對雷公藤懸浮細胞中雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內(nèi)酯等多種萜類成分進行UPLC-MS測定后，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素的出峰時間相對較快（RT=2.7 min），雷公藤紅素的出峰時間相對較慢（RT=11.5 min），而雷酚內(nèi)酯的相對含量最高，故以雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內(nèi)酯的得率來判斷雷公藤懸浮細胞中總萜類成分的提取率切實可行。同時，考慮到本研究選用多指標進行提取方法的優(yōu)化，故選用應用較為廣泛的主觀權重系數(shù)AHP法計算權重系數(shù)[17-21]，綜合考慮各指標間的相關性和數(shù)據(jù)的變異性，既能反映提取物有效成分的綜合信息，又能為工藝的優(yōu)化增加合理性，保證試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。