何飛 ，潘曉芬 ，陳永昌 ，梁昌達(dá) ，易麗君 ，李紅

(1、江西省兒童醫(yī)院，江西 南昌 330000；2、江西省兒科研究所中心實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330000；3、江西省全南縣人民醫(yī)院，江西全南341800)

急性 髓系 白 血 病 （acute myeloid leukemia，AML）是造血系統(tǒng)的髓系原始細(xì)胞克隆性惡性增殖性疾病，是一個具有高度異質(zhì)性的疾病群，它由正常髓系細(xì)胞分化發(fā)育過程中不同階段的造血祖細(xì)胞惡性變轉(zhuǎn)化[1]。白血病的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，盡管目前研究已經(jīng)明確部分可能因素，但其病因仍未被完全闡明。多數(shù)研究表明白血病是環(huán)境因素與細(xì)胞遺傳物質(zhì)相互作用形成各種染色體易位或融合基因所致。t(8；21)(q22；q22)是急性髓系白血病最常見的非隨機(jī)染色體易位，約40%～50%的AML1－M2(FAB分型)存在此種染色體易位[2]。染色體易位(8；21)合成的融合蛋白AML－ETO作為白血病發(fā)展的起始致癌基因，在白血病的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用，并且AE融合蛋白存在多個轉(zhuǎn)錄本[3]，其中AE9a的致白血病作用最明顯[4]。隨著長期存活率的提高，如何提前預(yù)測復(fù)發(fā)成為白血病治療策略改變的一個發(fā)展方向，微小殘留病的監(jiān)測是最常用的方法之一，研究表明[5]約87%伴有t(8；21)的AML－M2患者中AE融合基因與AE9a異構(gòu)體共表達(dá)，據(jù)此，本文通過建立相對定量的方法，監(jiān)測46例患者多次隨訪標(biāo)本中AE及AE9a相對量的變化，探討聯(lián)合監(jiān)測AE及AE9a在微小殘留白血病(MRD)監(jiān)測中可能存在的臨床意義。

1 資料與方法

1．1 病例來源 46份ETO基因陽性骨髓標(biāo)本采自2010年6月至2014年6月江西省兒童醫(yī)院血液科住院及門診患者，發(fā)病時一般情況：87%患兒（40例）有反復(fù)發(fā)熱；12例患兒初診時外周血白細(xì)胞數(shù)大于50×109/l；36例患兒骨髓幼稚細(xì)胞比例大于50%，10 例患兒比例為 20%～50%。診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：1．臨床癥狀、體征：發(fā)熱、蒼白、乏力、出血、骨關(guān)節(jié)疼痛及肝脾淋巴結(jié)腫大等浸潤灶表現(xiàn)；2．血象改變：血紅蛋白及紅細(xì)胞降低，血小板減少，白細(xì)胞增高、正常或減低，分類可發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的原、幼粒（或幼單）細(xì)胞或未見原、幼粒（或幼單）細(xì)胞；3．骨髓形態(tài)學(xué)改變：是確診的主要依據(jù)，骨髓涂片中有核細(xì)胞大多呈明顯增生或極度增生，僅少數(shù)呈增生低下，均以髓細(xì)胞增生為主，原粒+早幼粒（或原單+幼單）細(xì)胞必須≥20%才能確診為AML；4．ETO融合基因陽性?；煼桨覆捎?006化療方案[6]，39例第一療程獲得緩解，7例第二療程獲得緩解。46例患兒隨訪3年未復(fù)發(fā)25例，3年內(nèi)復(fù)發(fā)21例。標(biāo)本檢測時間為初診時、誘導(dǎo)化療結(jié)束時、隨訪每6個月檢測1次以及復(fù)發(fā)時，隨訪時間為3年。

1．2 試劑與儀器 RT－PCR擴(kuò)增試劑為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；實(shí)時定量PCR擴(kuò)增試劑為ABI公司產(chǎn)品；RT－PCR及實(shí)時定量PCR引物和TaqMan探針均由金瑞斯生物科技有限公司合成；RT－PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司ABI7500；實(shí)時定量PCR擴(kuò)增儀為MJ Research公司產(chǎn)品；電泳儀為Bio－Bad公司產(chǎn)品；紫外透視分析儀為Bio－CAPTver鄄sion99(VLIBERLOURMAT)。

1．3 RT－PCR 收集46例患兒各個監(jiān)測點(diǎn)的骨髓標(biāo)本，用Ficoll液分離骨髓MNC，用Trizol一步法及氯仿．異丙醇提取總 RNA，調(diào)濃度至 0．5ug/ul，取4ul并逆轉(zhuǎn)成cDNA40u1

1．4 定性PCR及實(shí)時定量PCR檢測AE9a和AE表達(dá)水平 擴(kuò)增 (包括9a外顯子)的AMLl－ETO(1530bp)長片段，將定性RT－PCR擴(kuò)增AE長片段所獲得的PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計特異性引物和TaqMan探針。PCR體系和擴(kuò)增條件按說明書執(zhí)行。

1．5 內(nèi)參基因?yàn)?Abl，其中 Abl引物及探針、AML1－ETO和9a異構(gòu)體的引物及探針序列選擇歐洲公布的抗癌項(xiàng)目序列。每例標(biāo)本的每個基因均做復(fù)孔檢測，通過標(biāo)本Ct值依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出標(biāo)準(zhǔn)中Abl、AE及AE9a拷貝數(shù)。計算AE和AE9a表達(dá)水平（%）=拷貝數(shù)/Abl拷貝數(shù)×100%。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對t檢驗(yàn)及四格表χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 AML1－ET09a異構(gòu)體檢測結(jié)果 在46例確診伴有t(8；21)的AML－M2患者的骨髓標(biāo)本中有 41例檢測到AE9a異構(gòu)體，占89．13%。21例復(fù)發(fā)患者均檢測到AE9a異構(gòu)體。

2．2 初診時 AE、AE9a的表達(dá) 41例 AE及 AE9a均陽性患者，21例復(fù)發(fā)，20例未復(fù)發(fā)，兩組患者AE及AE9a表達(dá)水平差異較大，但復(fù)發(fā)組平均表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組，并且兩組對比AE9a比AE高的更明顯(P＜0．01)，見表 1、圖 1。

2．3 初治后AE、AE9a的表達(dá) 46例患者經(jīng)首次標(biāo)準(zhǔn)方案化療后AE表達(dá)水平較初診時明顯下降，但復(fù)發(fā)組下降的百分比低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0．05)；41例AE9a陽性患者化療后表達(dá)水平也明顯下降，同樣復(fù)發(fā)組下降的百分比低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)；比較復(fù)發(fā)組AE、AE9a化療前后的變化發(fā)現(xiàn)，AE下降的水平明顯高于 AE9a(P＜0．01)。 見圖 2。

表1 41例AE、AE9a表達(dá)陽性患者誘導(dǎo)化療前后表達(dá)水平（拷貝數(shù)/Abl拷貝數(shù)×100%）的變化

2．4 復(fù)發(fā)患者AE、AE9a表達(dá)水平的變化 21例復(fù)發(fā)患者復(fù)發(fā)時AE與AE9a表達(dá)水平均上升。66．7%(21例中14例)的患者在AE融合基因表達(dá)水平升高以及最終的形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)之前，AE9a已開始出現(xiàn)升高，甚至異常升高，而此時AE融合基因的表達(dá)處于較低水平。其余7例患者中5例AE9a表達(dá)水平升高與AE融合基因升高同步，并未提前；2例患者自發(fā)病至復(fù)發(fā)AE9a表達(dá)持續(xù)在較高水平，AE表達(dá)亦持續(xù)在較高水平，并且這2例在鞏固治療期間即復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)組AE及AE9a基因轉(zhuǎn)陰時間似乎比未復(fù)發(fā)組更晚，是不是提示轉(zhuǎn)陰時間與復(fù)發(fā)相關(guān)，但由于隨訪監(jiān)測為6個月1次，對比無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組治療前比較

圖2 化療后復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)組AE和AE9a下降幅度比較

3 討論

急性髓系白血病常常伴有多種類型的基因突變或融合基因[7]，AML1－ETO 作為 t(8；21)AML 典型的融合基因，既往用于微小殘留白血病的監(jiān)測[8]，但近期研究發(fā)現(xiàn)AE融合基因存在于部分正常人和非白血病細(xì)胞系及伴有t(8；21)AML獲得緩解的患者骨髓細(xì)胞中可持續(xù)低表達(dá)，因而單獨(dú)檢測AE并不能很好的預(yù)測白血病復(fù)發(fā)[9]；表明AE融合基因單獨(dú)并不能引起白血病的發(fā)生，需獲得額外的突變才能轉(zhuǎn)化為白血病[10]。Wolford[3]通過對t(8；21)患者骨髓樣本進(jìn)行RT－PCR檢測，證明存在多種AMLl－ETO轉(zhuǎn)錄本，AE9a是其中一種最常見的；Yan等[11]通過建立動物模型研究AE及其異構(gòu)體AE9a的致白血病作用，發(fā)現(xiàn)AE9a與白血病發(fā)生的關(guān)系較AE更緊密，這就讓我們思考是否可利用監(jiān)測AE和AE9a來達(dá)到監(jiān)測微小殘留病的目的。

本研究中，89．13%(41/46)確診伴有 t(8；21)的AML－M2患者中檢測到AE9a異構(gòu)體的表達(dá)，證實(shí)了AE9a異構(gòu)體與AE融合基因具有高度相關(guān)性，提示作為MRD監(jiān)測指標(biāo)的可行性。初診患者經(jīng)1個療程標(biāo)準(zhǔn)方案化療后，AE與AE9a的表達(dá)水平均有所下降，特別在未復(fù)發(fā)組患者中兩者的表達(dá)水平下降較明顯，但在復(fù)發(fā)組AE下降的水平明顯高于 AE9a(P＜0．01)，表明 AE9a 表達(dá)水平下降幅度較AE低，至此我們推測高表達(dá)AE9a異構(gòu)體的白血病細(xì)胞對化療的敏感性較低表達(dá)AE9a的白血病細(xì)胞差，可能在疾病的發(fā)生及進(jìn)展中占更加重要的地位。這與李林萌[12]研究結(jié)果一致，AE9a異構(gòu)體可能在疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮比AE更重要的作用。

是否可以單獨(dú)監(jiān)測AE9a來預(yù)測白血病復(fù)發(fā)呢？DeKelver RC[13]以及 Wang Z[14]報道中指出，AE9a基因總的表達(dá)水平較低，拷貝數(shù)與內(nèi)參基因?qū)Ρ?，常常低?0－4，在目前實(shí)驗(yàn)方法不能精確到10－6或更低級別情況下不宜單獨(dú)作為監(jiān)測指標(biāo)。Link KA[15]發(fā)現(xiàn)AE可使長期培養(yǎng)的人臍帶血CD34+細(xì)胞不出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，但如果僅僅有9a轉(zhuǎn)錄本似乎存在缺陷，AE和AE9a的共轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致了表達(dá)細(xì)胞的選擇性生長。本實(shí)驗(yàn)中，緩解期間66．7%(14/21)確診伴有 t(8；21)的 AML－M2 患者在AE水平升高以及最終的形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)之前，AE9a表達(dá)水平已開始出現(xiàn)升高，而此時AE融合基因拷貝數(shù)處于較低水平。其余7例患者中4例AE9a百分比升高與AE融合基因升高同步，并未提前，可能與隨訪時間點(diǎn)比較少有關(guān)；2例自發(fā)病至復(fù)發(fā)，AE融合基因及AE9a百分比持續(xù)在較高水平。另外緩解期間，AE9a在復(fù)發(fā)組中表達(dá)水平高于非復(fù)發(fā)患者，說明AE9a在白血病中長期存在很可能是AML復(fù)發(fā)的重要影響因素，在白血病復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。本研究由于復(fù)發(fā)病例數(shù)較少，并且隨訪時間點(diǎn)為6個月，所以并不能說明AE9a比AE更好的作為MRD的監(jiān)測指標(biāo)，增加入組病例以及增加隨訪時間點(diǎn)，應(yīng)該能得到更好的答案。

總之，在緩解期聯(lián)合檢測AE及AE9a表達(dá)水平的變化，作為微小殘留病的監(jiān)測，可能比單獨(dú)監(jiān)測AE融合基因能更早預(yù)測疾病的發(fā)展，從而可提前進(jìn)行臨床干預(yù)，降低患者的復(fù)發(fā)率，提高患者的長期生存率。