梁杰 李功義

摘要 根據(jù)大興安嶺馬鈴薯種薯生產(chǎn)實(shí)際，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）檢測莖尖組織培養(yǎng)試管苗的帶毒情況，鑒定危害馬鈴薯生產(chǎn)的6種主要病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV），并結(jié)合指示植物如千日紅進(jìn)行最后鑒定，篩選健康、無毒的試管苗，為切段擴(kuò)繁及試管薯生產(chǎn)作準(zhǔn)備。該方法簡單易操作，可作為國內(nèi)生產(chǎn)脫毒種薯單位的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行推廣。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯試管苗；病毒檢測；酶聯(lián)免疫吸附檢測法；指示植物接種鑒定法

中圖分類號(hào) S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）19-0081-01

在生產(chǎn)上，馬鈴薯以無性繁殖為主，種植過程中容易感染病毒，并通過塊莖世代傳遞，導(dǎo)致病害逐年加重、馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]。由于脫毒苗有再侵染的可能，對(duì)基本無毒核心苗進(jìn)行連續(xù)跟蹤檢測[2-3]，以保證試管苗質(zhì)量。對(duì)黑龍江省主栽馬鈴薯品種脫毒試管苗按株系進(jìn)行檢測篩選，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳方法（R-PAGE），檢測主栽品種脫毒試管苗帶類病毒狀況，篩選出無類病毒的試管苗株系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯試管苗材料來源于黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學(xué)院組培室，以東農(nóng)303、早大白、費(fèi)烏瑞它、尤金、中薯一號(hào)、大西洋、鄭薯6號(hào)、克新13號(hào)、諾蘭、中薯3號(hào)、中大一號(hào)馬鈴薯試管苗作為檢測樣品；馬鈴薯病毒檢測試劑盒購于瑞士，由蘇慶祥（博士）代購。

1.2 儀器和設(shè)備

聚苯烯微量滴定板（96孔）、酶聯(lián)檢測儀、微量可調(diào)進(jìn)樣器（0.5～10.0 ？滋L、10.0～40.0 ？滋L、40.0～200.0 ？滋L 3個(gè)規(guī)格）及相應(yīng)規(guī)格的塑料頭、電光天平（精確到0.1 mg）、冰箱、培養(yǎng)箱（溫度定為37 ℃）、瓷研缽。

1.3 試劑及配制方法

試劑為分析純，用水為蒸餾水。

抗體免疫球蛋白（r-globulin）和酶標(biāo)抗體（Coniugate）：從某一馬鈴薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的某一病毒的免疫球蛋白的酶標(biāo)記抗體，一般使用濃度常在1∶1 000以上。貯藏于4 ℃條件下備用。

碳酸鹽包被緩沖液：pH值9.6，取無水碳酸鈉（Na2CO3）1.59 g與碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93 g，定溶于1 L蒸餾水中。

PBS-Tween20緩沖液：pH值7.4，用于洗滌微量滴定板。配制方法為氯化鈉（NaCl）8 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g、七水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·7H2O）2.2 g[或十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9 g]、氯化鉀（KCl）0.2 g、迭氮化鈉（NaN3）0.2 g，加水至1 L，然后加0.5 mL Tween-20。

樣品緩沖液為PBS-Tween20+2%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。底物緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液25.7 mL+0.1 mol/L檸檬酸溶液24.3 mL+水50 mL，pH值5.0，臨用前加鄰苯二胺40 mg、30%H2O2（過氧化氫）0.15 mL，混勻，避光放置，應(yīng)為白色或微黃色溶液。

終止液：堿性磷酸酯酶用3 mol/L NaOH中止，辣根過氧化物酶用2 mol/L H2SO4終止。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）酶聯(lián)免疫吸附檢測法。設(shè)定2個(gè)陰性對(duì)照A1、B1， 2 個(gè)陽性對(duì)照C1、D1，2個(gè)空白E1、F1。取東農(nóng)303、早大白、鄭薯6號(hào)、費(fèi)烏瑞它、尤金、中薯一號(hào)、大西洋、克新13號(hào)、諾蘭、中薯3號(hào)、中大一號(hào)馬鈴薯試管苗，每個(gè)品種取8支試管苗進(jìn)行檢測，分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)，1號(hào)試管苗第1支記為11號(hào)、1號(hào)試管苗第8支記為18號(hào)，以此類推。

（2）指示植物接種鑒定法。取各參試馬鈴薯品種試管苗汁液作為檢測樣品，接種于千日紅葉片，檢測6種主要病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）。

1.5 操作方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測法。

（1）包被微量滴定板。將免疫球蛋白用包被緩沖液按1∶1 000稀釋，用微量進(jìn)樣器向微量滴定板的每一樣品孔內(nèi)加入稀釋的免疫球蛋白200 ？滋L，在37 ℃條件下孵育4 h或在4 ℃條件下過夜。

（2）洗滌包被的微量滴定板。甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀釋液，再在一疊吸水紙上敲打微量滴定板。向微量滴定板的樣品孔中加滿洗滌液，停留3 min，甩掉洗滌緩沖液，共洗滌3次，以除盡未被吸附的免疫球蛋白。

（3）加被檢測的樣品。在無菌條件下，從試管苗上剪下長2 cm莖段，放在小研缽內(nèi)，將取樣后的試管苗放回試管中并封口，對(duì)樣品編號(hào)，以便根據(jù)檢測結(jié)果取舍。向小研缽中加樣品緩沖液，加入的量根據(jù)上樣孔數(shù)而定，研磨。每孔加200 ？滋L檢測樣品，每1塊微量滴定板上可設(shè)置陽性對(duì)照1個(gè)、空白對(duì)照1個(gè)，37 ℃孵育4 h或4 ℃條件下過夜。

（4）顯色。洗板后，加入用樣品緩沖液1∶1 000稀釋的酶標(biāo)記抗體，每孔加200 ？滋L；再洗板，然后加入底物緩沖液100 ？滋L，當(dāng)一些樣品孔間顯現(xiàn)不同顏色時(shí)，加入50 mL終止液。

（5）讀取結(jié)果。一是目測觀察。顯現(xiàn)顏色深淺與病毒相對(duì)濃度成正比。顯現(xiàn)白色為陰性反應(yīng)，記錄為“-”；顯現(xiàn)淡橘紅色為陽性反應(yīng)，記錄為“+”，依色澤逐漸加深記錄為“++”和“+++”。二是用酶聯(lián)檢測儀測定光密度值。樣品孔的光密度值大于陰性對(duì)照光密度值的2倍，即確定為陽性反應(yīng)（陰性對(duì)照孔的光密度值應(yīng)≤0.1）。

1.5.2 指示植物接種鑒定法。2017年3月10日，用磷酸緩沖液提取試管苗汁液，用600目金鋼砂均勻噴灑在葉子表面，用脫脂棉做成小棉棒，用鑷子夾著蘸取汁液摩擦接種在千日紅（Gomphrena globosal）離體葉片上，及時(shí)用清水沖掉接種葉片上的雜物。6～7 d后，逐日觀察癥狀反應(yīng)。沒有表現(xiàn)出明顯病毒癥狀，說明脫毒基礎(chǔ)苗病毒含量低或沒有。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測法

檢測樣品提取液注入凹槽為200 μL，酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）鑒定PVX病毒，只有含PVX濃度較高，超過對(duì)照陽性樣品含量，才視為含PVX。由病毒顏色反應(yīng)可以看出，1號(hào)（A2-H2）、2號(hào)（A3-H3）、3號(hào)（A4-H4）、4號(hào)（A5-H5）、5號(hào)（A6-H6）、6號(hào)（A7-H7）、7號(hào)（A8-H8）、8號(hào)（A9-H9）、9號(hào)（A10-H10）、10號(hào)（A11-H11）、11號(hào)（A12-H12）馬鈴薯樣品均不含PVX。田間未發(fā)現(xiàn)其他幾種病毒表現(xiàn)出癥狀，故未檢測。

2.2 指示植物接種鑒定法

千日紅為鑒定PVX的最有效指示植物。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種葉片上有明顯紫紅色環(huán)狀枯斑癥狀，說明大西洋試管苗含馬鈴薯X病毒（PVX）。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（DAS-ELISA）結(jié)合指示植物鑒定篩選脫毒基礎(chǔ)苗，方法簡單易操作，可作為國內(nèi)生產(chǎn)脫毒種薯單位的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行推廣。

采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，從瑞士引進(jìn)馬鈴薯病毒檢測試劑盒（PVX、PVY、PVS、PLRV），應(yīng)用Coda全自動(dòng)酶免系統(tǒng)，除人工包板、研樣外，加樣、洗板、加酶標(biāo)、洗板、加底物、孵育、洗板等一系列工作都在計(jì)算機(jī)操縱下進(jìn)行，一次能檢測3塊板270個(gè)樣品，減少了工作環(huán)境和人為誤差，大大提高了檢測質(zhì)量、速度、數(shù)量，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模種薯檢驗(yàn)，保證了脫毒種薯質(zhì)量[4-5]。指示植物接種鑒定法較常使用，主要根據(jù)病毒在指示植物上的癥狀，但要花費(fèi)較多時(shí)間，一般為6～7 d。此外，在寄主上的癥狀表現(xiàn)還受環(huán)境（如溫度、光強(qiáng)度等）影響，會(huì)阻礙指示植物鑒定法快速對(duì)病毒病的預(yù)測，一般只作為定性檢測手段[6]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 吳凌娟，張雅奎，溫福君，等.馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)在大興安嶺種薯生產(chǎn)上的應(yīng)用[J].中國馬鈴薯，1998（3）：35-37.

[2] 蔣先林，楊魯生，丁云雙，等.低緯高原馬鈴薯脫毒種薯標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（35）：13506-13509.

[3] 左曉斌，鄒積田.脫毒馬鈴薯良種繁育與栽培技術(shù)[M].北京：科學(xué)普及出版社，2012.

[4] 郭志乾，吳林科，趙永峰.馬鈴薯優(yōu)良品種及配套栽培技術(shù)[M].銀川：寧夏人民出版社，2009.

[5] 劉在東.馬鈴薯Y病毒分子檢測試劑盒的研制及株系普查[D].沈陽：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6] 張麗珍，董家紅，鄭寬瑜，等.云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析[J].中國馬鈴薯，2015，29（1）：42-45.