周錦禎，徐紅，陳玲，劉婷婷，郭偉鵬

（1.華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室；廣東省微生物分析檢測中心；廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）

（2.樂百氏（廣東）食品飲料有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，廣東中山 528400）

霉菌和酵母廣泛分布于自然界，如空氣、水和土壤。其中有些霉菌和酵母對人類是有益的，常被用于釀造、發(fā)酵食品等工業(yè)。但在某些情況下，霉菌和酵母也可造成食品腐敗變質(zhì)，有的還能產(chǎn)生真菌毒素。因此，霉菌和酵母是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌。

近年來，飲料工業(yè)發(fā)展迅速，功能性飲料更是保持較高的增長速度, 獲得較大發(fā)展[1]。飲料作為一種特殊的食品，由于防腐劑的限量加入，以及受限于生產(chǎn)殺菌工藝，易受微生物污染，尤其是霉菌與酵母，會導(dǎo)致飲料變質(zhì)，如變色、沉淀，渾濁和漲罐等，其污染的來源來自于原料、設(shè)備、車間環(huán)境[2,3]等等。因此，加強(qiáng)對飲料中霉菌和酵母的監(jiān)控顯得尤為重要。3M PetrifilmTM快速測試片微生物檢測產(chǎn)品作為微生物快速檢測技術(shù)之一，在全球食品檢測領(lǐng)域得到廣泛使用。其中3M PetrifilmTM快速霉菌酵母測試片可用于食品和飲料行業(yè)中的霉菌和酵母的計(jì)數(shù)，與傳統(tǒng)的方法相比其培養(yǎng)時(shí)間由5 d縮短為48 h，特別適合大批量樣品食品樣品中的快速檢測，由于沒有培養(yǎng)基消毒與配置環(huán)節(jié)，操作程序也更加簡便，有助于提高微生物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和提高工作效率[4～6]。但由于其不是我國食品微生物檢驗(yàn)的國家標(biāo)準(zhǔn)，所以也無法在檢測機(jī)構(gòu)和食品企業(yè)中得到大規(guī)模的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選擇白色念珠菌（Candida albicans）、擬熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、綠木霉（Trichoderma virens）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別采用3M PetrifilmTM快速測試片法（以下簡稱：測試片法）和國標(biāo)法對某維生素飲料進(jìn)行霉菌和酵母計(jì)數(shù)試驗(yàn)，結(jié)果用以驗(yàn)證3M PetrifilmTM快速測試片法（以下簡稱：測試片法）的重復(fù)性、特異性及其與國標(biāo)法的比較試驗(yàn)，以確認(rèn)兩種方法是否存在顯著性差異，為企業(yè)建立快速測試片法作為日常監(jiān)控霉菌和酵母的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

市售某功能維生素飲料。

1.1.2 培養(yǎng)基

3M PetrifilmTM快速霉菌酵母測試片，美國3M公司生產(chǎn)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種

通過篩選實(shí)驗(yàn)選擇可在某飲料產(chǎn)品中存活的霉菌或酵母,最終確認(rèn)選取以下菌株進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)菌株：白色念珠菌Candida albicans（ATCC 10231）、擬熱帶假絲酵母Candida tropicalis（GIM 2.112）、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii（GIM 2.184）、綠木霉 Trichoderma virens（GIM 3.548）、炭黑曲霉Aspergillus carbonarius(GIM 3.146)，以上菌株均來源于廣東省微生物菌種保藏中心（國家專利菌種保藏平臺）。分離菌株（來源：樂百氏（廣東）食品飲料有限公司中心實(shí)驗(yàn)室）：蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus(Wild Type)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌Bacillus firmus (Wild Type)、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(Wild Type)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、振蕩器、微量移液器及無菌吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、無菌試管等均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株適用性試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株白色念珠菌Candida albicans（ATCC 10231）、擬熱帶假絲酵母 Candida tropicalis（GIM 2.112）、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii（GIM 2.184）、綠木霉 Trichoderma virens（GIM 3.548）、炭黑曲霉Aspergillus carbonarius （GIM 3.146）制成一定濃度的菌懸液加入100 mL樣品飲料中，制成終濃度為10～150 CFU/mL的樣品，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果，以驗(yàn)證樣品對所測試菌株是否有生長抑制性。

1.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參照SN/T1800-2006食品和動物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法中重復(fù)性要求進(jìn)行快速測試片法檢測霉菌和酵母的實(shí)驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行分析。

重復(fù)性：使用相同方法，由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)的兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)結(jié)果的絕對差值，不應(yīng)大于重復(fù)性限，r=0.25，以10為底的每毫升中微生物計(jì)數(shù)的對數(shù)。

檢驗(yàn)結(jié)果解釋：第一結(jié)果：105=100000，第一結(jié)果和第二結(jié)果之間的差值不應(yīng)大于0.25 log10單位，第二結(jié)果：log104.7=56000或log5.25=17800。如果第一結(jié)果不低于56000或不高于178000，則第一結(jié)果和第二結(jié)果之間是差值是可以接受的。

方法：將試驗(yàn)菌株制成一定濃度的菌懸液，加入100 mL樣品飲料中，制成終濃度為10～150 CFU/mL的待測樣品。用測試片法對加標(biāo)樣品進(jìn)行霉菌和酵母的檢測，每個(gè)樣品由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)，分析結(jié)果。

1.2.3 快速測試片對所選菌株的的特異性試驗(yàn)

試驗(yàn)使用芽孢、霉菌、酵母分別制成單一菌懸液或混合菌懸液使用測試片法進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)和酵母計(jì)數(shù)的檢測，同時(shí)使用平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)中所選用的芽孢菌株：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus (Wild Type)、強(qiáng)壯類芽孢桿菌Paenibacillusehimensis(Wild Type)、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(Wild Type)，主要是考慮產(chǎn)品中或生產(chǎn)環(huán)境中可能出現(xiàn)的菌。霉菌和酵母制備出低濃度水平（10～150 CFU/mL）的菌懸液，芽孢制備成高濃度水平（100～1500 CFU/mL）的菌懸液。

1.2.4 比較試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株制成一定濃度的菌懸液，加入100 mL飲料中，制成終濃度為10～150 CFU/mL的待測樣品。使用測試片法和國標(biāo)檢驗(yàn)方法GB 4789.15-2016 第一法[6]分別對樣品進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)和酵母計(jì)數(shù)檢測，每個(gè)樣品分別使用兩種方法重復(fù)檢測10次，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，使用F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析兩種檢測方法結(jié)果間的差異。

測試片法：按產(chǎn)品使用操作說明，取1 mL待測樣品置于快速測試片中，置于25 ℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

國標(biāo)法：按國標(biāo)操作方法，取1 mL待測樣品于平皿內(nèi)，傾注馬拉松葡萄糖瓊脂，置于 28 ℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析[7]：試驗(yàn)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，給定顯著性水平α（本實(shí)驗(yàn)α=0.05）后，SPSS軟件中的統(tǒng)計(jì)決策通過以下兩步完成：

第一步，利用F檢驗(yàn)判斷兩總體的方差是否相等，并據(jù)此決定抽樣分布方差和自由度的估算方法和計(jì)算結(jié)果。如果F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的概率p值(顯著性sig值)，小于顯著性水平α（0.05），則應(yīng)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為兩總體方差有顯著差異，反之，如果概率p值大于顯著性水平α（0.05），則不應(yīng)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為兩總體方差無顯著差異。

第二步，利用t檢驗(yàn)判斷兩總體均值是否存在顯著性差異，如果t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的概率p值(顯著性sig值),小于顯著性水平α（0.05），則應(yīng)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為兩總體均值有顯著差異，反之，如果概率p值大于顯著性水平α（0.05），則不應(yīng)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為兩總體均值無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株適用性試驗(yàn)結(jié)果

由表1知，白色念珠菌Candida albicans（ATCC 10231）、擬熱帶假絲酵母Candida tropicalis（GIM 2.112）、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii（GIM 2.184）、綠木霉Trichoderma virens（GIM 3.548）、炭黑曲霉Aspergillus carbonarius（GIM 3.146）在該飲料中25 ℃培養(yǎng)5 d后，加入酵母的樣品呈渾濁生長，經(jīng)鏡檢為酵母，加入霉菌的樣品有白色絮狀物生長，經(jīng)鏡檢為霉菌菌絲，結(jié)果表明所測試菌株均能在樣品中生長良好，樣品對所選菌株無生長抑制性。

表1 菌株預(yù)選試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Strain preselection test results

2.2 測試片法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，參照SN/T1800-2006食品和動物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法中重復(fù)性要求，同一操作者使用快速測試片對樣品飲料使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)，結(jié)果表明第二次測試的結(jié)果均在第一次的可接受范圍內(nèi)，則第一次結(jié)果和第二次結(jié)果之間的差值是可以接受的。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability test results

2.3 測試片法對所選菌株的的特異性測試結(jié)果

由表3測試結(jié)果可知，對所選擇的菌株進(jìn)行測試，所添加的高濃度芽孢等細(xì)菌均不會對快速測試片進(jìn)行霉菌和酵母的檢測造成明顯的干擾，測試片法具有較強(qiáng)特異性。

表3 特異性測試結(jié)果Table 3 Specificity test results

2.4 比較試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，用測試片和國標(biāo)法分別對添加菌液的樣品進(jìn)行霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測，每個(gè)樣品分別使用兩種方法重復(fù)檢測10次，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，給定顯著性水平α（本實(shí)驗(yàn)α=0.05）后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的概率p值(顯著性sig值)分別為：0.475、0.451、0.312、0.291、0.436，均大于顯著性水平α=0.05，不能拒絕方差相等的假設(shè)；方差相等時(shí)，t檢驗(yàn)的相伴概率sig值分別為：0.384、0.116、0.155、0.675、0.059，均大于顯著性水平α=0.05，不能拒絕t檢驗(yàn)的零假設(shè)，表示兩種方法總體均值無顯著差異。

表4 F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果Table 4 F test and t test results

3 結(jié)論

3.1 通過應(yīng)用測試片法與國標(biāo)法對白色念珠菌、擬熱帶假絲酵母、漢遜德巴利酵母、綠木霉、炭黑曲霉等菌株進(jìn)行試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)所用酵母和霉菌測試片，其培養(yǎng)基含有作為載體的冷水可溶性凝膠和對霉菌和酵母敏感的指示劑（5-溴-4-氯-3吲哚基-磷酸鹽），與酵母、霉菌在培養(yǎng)生長過程中發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，通過生長特征和顏色變化來判定霉菌和酵母的種類和數(shù)量。另外還添加氯四環(huán)素、氯霉素抑制細(xì)菌生長，酵母菌落特征為灰白色到蘭綠色，較小，邊緣清晰，菌落隆起，菌落顏色較為均勻一致，沒有暗色中心。霉菌菌落特征為通常為蘭綠色，但是也會呈現(xiàn)它們本身的顏色(如黑、黃、綠)，以霉菌產(chǎn)生不同色素而定，較大，菌落扁平，邊緣不清晰，有擴(kuò)散，通常菌落中心顏色深暗?？焖贉y試片檢測霉菌，不易蔓延和重疊，有效地提高了判讀的簡便性，且可同時(shí)評估霉菌和酵母，也可以通過區(qū)別菌落形態(tài)的不同來單獨(dú)監(jiān)控這兩種真菌。但測試片法具有一定的局限性，因測試紙片面積較小，當(dāng)菌落大于250 CFU時(shí)，準(zhǔn)確計(jì)算較困難；在48 h的時(shí)候查看酵母和霉菌結(jié)果，某些生長緩慢的酵母和霉菌可能在 48 h的時(shí)候表現(xiàn)模糊，為了強(qiáng)化判讀，可以額外增加12 h的培養(yǎng)時(shí)間；待測樣品中含有的某些有機(jī)物可能使顯色減緩，使目視效果下降導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低；價(jià)格昂貴等等，這些都是值得引起注意與探討的[8,9]。但總體而言，快速微生物測試片已經(jīng)通過國際組織AOAC的認(rèn)可[10]，許多研究也顯示快速微生物測試片與傳統(tǒng)方法相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異[11～14]。

3.2 本實(shí)驗(yàn)菌株預(yù)選試驗(yàn)中白色念珠菌（Candida albicans）、擬熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、綠木霉（Trichoderma virens）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius），在該飲料中28 ℃培養(yǎng)5 d，均能生長良好，導(dǎo)致飲料渾濁或產(chǎn)生絮狀物。果汁飲料發(fā)生變質(zhì)而出現(xiàn)渾濁除了由化學(xué)因素引起除外，大多數(shù)由微生物污染而造成，特別是酵母以及霉菌，其中一些可能由耐熱性的霉菌造成的，微生物引起的果汁飲料變質(zhì)通常會出現(xiàn)渾濁，產(chǎn)生和導(dǎo)致有機(jī)酸的變化[15]，一些霉菌（如青霉，雪白絲衣霉等）可在短時(shí)間（14 d內(nèi)）將維生素飲料中維生素B3消耗殆盡[16]。

3.3 對于定量微生物檢驗(yàn)方法，方法的特異性、靈敏度、相對真實(shí)度、陽性偏差、陰性偏差、重復(fù)性、再現(xiàn)性以及可變范圍內(nèi)的檢驗(yàn)局限性都應(yīng)予以考慮。本研究中主要考慮了特異性和重復(fù)性。在重復(fù)性試驗(yàn)中，參照SN/T1800-2006食品和動物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法中重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性要求進(jìn)行快速測試片法檢測霉菌和酵母的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，李志培等[17]就提出無論是理論計(jì)算或試驗(yàn)檢測，會發(fā)現(xiàn)重復(fù)性限的范圍是很寬的，所以對數(shù)據(jù)的要求并不高或不嚴(yán)格，可以根據(jù)實(shí)際情況采取等效的，更嚴(yán)格的控制方法和標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 在特異性試驗(yàn)中篩選的主要是考慮產(chǎn)品中或生產(chǎn)環(huán)境中可能出現(xiàn)的菌。如需深入研究其特異性，需增加更多數(shù)量的目標(biāo)菌。