王羽晗 李子豪 李世彪 陳馳航 王瑜麟 張旸

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

由于全球氣候驟變，天氣條件不確定，霜凍造成了農(nóng)作物的損失大幅度增加，而且變得越來越嚴(yán)重。據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，未來50年世界人口將增加9-12億，這將需要多生產(chǎn)34%-70%的糧食。因此，食糧供求之間的矛盾將會(huì)越來越突出。為了減緩這一矛盾，培育出耐寒性強(qiáng)的作物品種至關(guān)重要。傳統(tǒng)育種方法時(shí)間長、工作量大，轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)勢逐漸體現(xiàn)。因此，了解植物體低溫脅迫耐受機(jī)制，通過轉(zhuǎn)基因等手段定向的改變植物抗寒能力具有很高的可行性。目前，植物抗寒相關(guān)研究主要集中在對抗寒轉(zhuǎn)錄因子的研究中［1］，抗寒轉(zhuǎn)錄因子普遍具有較多的功能，轉(zhuǎn)基因植物可能會(huì)產(chǎn)生新的性狀。因此，利用抗寒轉(zhuǎn)錄因子來提高植株抗寒能力十分復(fù)雜，通過多年的研究，抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的發(fā)現(xiàn)在一定水平上解決了這個(gè)問題。

抗凍蛋白可以通過降低體系冰點(diǎn)、改變冰晶形態(tài)、抑制冰晶生長來防止低溫脅迫對生物體細(xì)胞造成損傷和致死，從而提高生物體對低溫的適應(yīng)能力，具備廣闊的應(yīng)用前景?？箖龅鞍椎难芯渴紫瘸霈F(xiàn)在魚類和昆蟲中，后來擴(kuò)大到微生物、動(dòng)物和植物中。目前，對于抗凍蛋白的研究主要集中在魚類［2-5］和昆蟲［6-9］，而在植物中的研究則比較晚［10-12］，也比較少，因此對于植物抗凍蛋白還需要深入研究，以提高植物抗寒能力，滿足人們生產(chǎn)生活的需要。本文將從抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)、效應(yīng)、活性的評價(jià)方式、作用機(jī)理、研究進(jìn)展及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 植物抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)

1964年，最早從黃粉甲幼蟲中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白［13］，1992年，Griffith等［14］從 冬 黑 麥（Secale cereale）葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了一種經(jīng)過低溫處理可以忍受細(xì)胞外結(jié)冰的蛋白，通過掃描電鏡顯示，冷馴化的冬黑麥通過形成這種蛋白，僅在細(xì)胞間隙中形成冰就使其可以忍受低溫，這種蛋白修飾了正常蛋白質(zhì)冰晶的生長模式和抑制低溫時(shí)水分流失，是在植物中分離純化的第一種抗凍蛋白。后來，Urrutia等［15］在對多種植物進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，可以使水溶液的非平衡凝固點(diǎn)下降的蛋白質(zhì)，即抗凍蛋白；1994年，費(fèi)云標(biāo)等［16］從抗凍植物沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）的葉片中分離純化得到一種具有熱穩(wěn)定性的蛋白，這種蛋白的抗凍活性比之前在魚類和黑麥中發(fā)現(xiàn)的高得多，并且在100-200倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其冰晶形態(tài)與經(jīng)過冷馴化的黑麥和魚類中的相似，呈多邊形，表明沙冬青中存在著具有高活性的抗凍蛋白；1998年，美國紐約大學(xué)的Sidebottom等［17］發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的抗凍蛋白基因也是園藝植物中最早發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因，且具有重要意義，并于2000年，從多年生黑麥草（Lolium perenne）中發(fā)現(xiàn)了具有熱穩(wěn)定性的抗凍蛋白，提高了黑麥草對低溫的適應(yīng)能力，使其可以越冬。

目前，在魚類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種類型的抗凍蛋白即抗凍糖蛋白、抗凍蛋白 I、抗凍蛋白Ⅱ、抗凍蛋白Ⅲ、抗凍蛋白Ⅳ?？箖鎏堑鞍字饕怯杀彼?丙氨酸-蘇氨酸的三肽單位串聯(lián)重復(fù)而成?？箖龅鞍?I無糖基，無三肽重復(fù)序列，具有最小的分子量和最簡單的結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)是由11個(gè)氨基酸殘基組成的多肽單元重復(fù)串聯(lián)而成?？箖龅鞍注蚍肿恿孔畲?，與動(dòng)物C型凝集素同源。抗凍蛋白Ⅲ的分子組成和順序與其他的抗凍蛋白完全不同，沒有占優(yōu)勢的非極性氨基酸，是一種球狀蛋白?？箖龅鞍注舻墓劝彼幔℅lutamic acid，Glu）含量很高［18］；在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白多存在于越冬的昆蟲體內(nèi)，以維持體液的過冷狀態(tài)，以下4種昆蟲抗凍蛋白的研究是最廣泛的，即黃粉蟲（Tenebrio molitor）、美洲脊胸長椿（Oncopeltus fasciatus）、樅色卷蛾（Choristoneura fumiferana）和甲蟲（Dendroides canadensis）。昆蟲抗凍蛋白含較多親水性氨基酸，無糖基，有40%-50%的氨基酸殘基能構(gòu)成氫鍵，活性比魚類抗凍蛋白高10-100倍，分子構(gòu)造也有所區(qū)別［19］；植物抗凍蛋白抑制冰晶形成能力較低，但通常含有多個(gè)親水性冰晶結(jié)合域，能夠防止冰晶增長從而對植物造成機(jī)械傷害。另外，還有許多植物的抗凍蛋白具備抗病的雙重功能［20］，與魚類和昆蟲抗凍蛋白相比，對植物抗凍蛋白的研究還不夠深入。

2 抗凍蛋白的效應(yīng)及抗凍活性的評價(jià)方法

2.1 抗凍蛋白的效應(yīng)簡介

抗凍蛋白具有3種效應(yīng)，即熱滯效應(yīng)（Thermal hysteresis activity，THA）、 重 結(jié) 晶 抑 制 效 應(yīng)（Recrystalization inhibition，RI）和冰晶形態(tài)效應(yīng)。

熱滯效應(yīng)是指抗凍蛋白與冰晶結(jié)合，導(dǎo)致低于其熔點(diǎn)的水溶液的非平衡凝固點(diǎn)下降。1個(gè)大氣壓下，純水在0℃時(shí)凍結(jié)，由于細(xì)胞液中各種溶質(zhì)的存在，其在-3--4℃凝固，而在抗凍蛋白存在的情況下，細(xì)胞液的凝固點(diǎn)進(jìn)一步降低，從而在一定水平上避免了植物中的冰晶的形成，提高了植物的抗寒能力。抗凍蛋白在降低冷凍溫度方面比任何其他已知的溶質(zhì)分子有效500倍［21-23］。具有較高熱滯后活性的抗凍蛋白稱為過度活躍的抗凍蛋白，中等活性的熱滯后活性的抗凍蛋白稱為中等抗凍蛋白，過度活躍的抗凍蛋白的過熱現(xiàn)象與中等抗凍蛋白相比更為明顯［24］。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白均有熱滯后活性，活性的大小與物種和抗凍蛋白的濃度有關(guān)。昆蟲具有最高的熱滯后活性，為3-5℃，然后是魚，約為2℃［25］，植物的熱滯后值大約為0-2℃。對于各種昆蟲和植物的抗凍蛋白，在濃度較低時(shí)，隨著抗凍蛋白濃度的增加，熱滯后活性急劇增加，當(dāng)抗凍蛋白濃度較高時(shí)，由于所有抗凍蛋白結(jié)合位點(diǎn)都被占據(jù)，熱滯后活性值沒有進(jìn)一步增加［26-28］。

重結(jié)晶抑制效應(yīng)是抑制已經(jīng)形成的冰晶顆粒中大的冰晶顆粒生長變得更大，而小的冰晶顆粒變小，大的冰晶取代小的冰晶，實(shí)現(xiàn)冰晶重新分配的過程。當(dāng)溫度降低到一定值時(shí)，冰結(jié)晶開始形成小的冰分子，由于范德華力、疏水相互作用及氫鍵作用［29］，在冰核的表面會(huì)吸附抗凍蛋白分子，抗凍蛋白分子會(huì)抑制冰晶分子的生長而且同時(shí)降低冰點(diǎn)，使冰晶不能聚集增大，稱為并再結(jié)晶抑制。較大的冰分子，對血漿膜造成物理壓力并可能使細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對細(xì)胞具有致命的威脅，抗凍蛋白的冰晶再結(jié)晶抑制效應(yīng)可以保護(hù)細(xì)胞免于機(jī)械性破裂死亡［30］。一般極低濃度的抗凍蛋白，大約低于0.1 μg/mL就可以抑制冰晶重結(jié)晶，使冰晶體積小且均勻，從而降低對植物的傷害［31］。另外，在保護(hù)機(jī)體不受傷害中，冰晶的重結(jié)晶抑制效應(yīng)可能比熱滯效應(yīng)更加重要，尤其是在抗凍植物與昆蟲中，因?yàn)橐种票е亟Y(jié)晶比抑制冰晶的生長更容易一些，對抗凍蛋白濃度的要求也更低一些［32］。

冰生長為一個(gè)六邊形晶格，在這個(gè)晶格中水分子通過氫鍵連在一起。單個(gè)冰晶有2個(gè)不同的平面即基面和棱柱面（圖1-A）。不存在抗凍蛋白時(shí)冰晶形態(tài)呈寬大圓盤狀（圖1-B），存在抗凍蛋白時(shí)，冰晶形態(tài)呈六角形，花形或針狀（圖1-C-圖1-G）［33］。存在抗凍蛋白時(shí)冰晶形態(tài)發(fā)生改變是因?yàn)榭箖龅鞍拙哂械谋螒B(tài)效應(yīng)從而能夠抑制冰晶的生長，在不同的生長方向上，抑制作用的抑制程度有區(qū)別，從而導(dǎo)致冰晶的生長習(xí)慣發(fā)生改變。冰晶通常以平行于冰晶基面（a軸）的方式生長，在垂直于冰晶基面的方向（c軸）生長緩慢。抗凍蛋白濃度低時(shí)，首先，冰晶沿a軸的生長會(huì)受到抑制，冰晶格的六邊柱表面變得明顯；當(dāng)抗凍蛋白濃度高時(shí)，冰晶主要以針形或者纖維狀的形式沿c軸生長，形成六邊雙棱錐及針形晶體［13］。這種形狀的冰晶對生物的傷害明顯低于以平行于冰晶基面（a軸）的方式生長形成的樹枝狀的冰晶，從而防止冰晶對細(xì)胞造成機(jī)械性的損害。因?yàn)榭箖龅鞍椎倪@種特性，也被稱為“冰結(jié)構(gòu)蛋白”［32］冰晶生長方向示意如圖2。

A：冰晶結(jié)構(gòu)；B：無防凍活性下冰晶生長形態(tài)；C-G：存在抗凍蛋白情況下冰晶生長的不同形態(tài)

2.2 抗凍蛋白抗凍活性評價(jià)方法

對抗凍蛋白活性進(jìn)行評價(jià)，以篩選出具有較高的適應(yīng)低溫能力的抗凍蛋白，從而滿足人們需求。因此，對抗凍蛋白的抗凍活性進(jìn)行準(zhǔn)確的評價(jià)和比較具有重要意義?，F(xiàn)有的抗凍蛋白活性評價(jià)方式主要是基于熱滯活性和冰晶重結(jié)晶抑制原理衍生出的定性或者定量的評價(jià)方式。熱滯活性的評價(jià)方式主要有冰晶形態(tài)圖像法和差示掃描量熱法（DSC）及兩者的結(jié)合；納升滲透壓計(jì)測量熱滯活性并提供冰晶形態(tài)；使用毛細(xì)管測定抗凍蛋白的冰晶重結(jié)晶抑制活性。不同方法測得的抗凍蛋白活性有時(shí)差異很大，主要是由于物種的來源、評價(jià)方式基于的原理及結(jié)果的表示方法的差異使得評價(jià)結(jié)果具有較大的不同，有的結(jié)果甚至是相互矛盾的，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，有些具有相同來源的抗凍蛋白，由于結(jié)構(gòu)、產(chǎn)地、測定方法的不同，所獲得的結(jié)果有時(shí)差異也很大［34］。另外，Gupta等［33］和Yu等［35］對黃粉蟲的抗凍蛋白活性進(jìn)行了測定，將熱滯活性高的稱為過度活躍的抗凍蛋白，低熱滯活性被稱為中度抗凍蛋白或Ⅲ型抗凍蛋白，過度活躍的抗凍蛋白比Ⅲ型抗凍蛋白的熱滯活性高10倍，而Ⅲ型抗凍蛋白的重結(jié)晶抑制活性比過度活躍的抗凍蛋白的高4倍，證明熱滯活性和冰晶重結(jié)晶抑制活性是抗凍蛋白的2個(gè)獨(dú)立的性質(zhì)，兩者之間沒有相關(guān)性。迄今為止，還沒有一種權(quán)威的、標(biāo)準(zhǔn)的抗凍蛋白活性評價(jià)方法，因此，限制了抗凍蛋白的研究與發(fā)展。

圖2 冰晶生長方向示意圖

在試驗(yàn)中，使用最多的抗凍蛋白活性評價(jià)方式是DSC法。1988年，Hansen等［36］首次使用DSC法檢測了黃粉蟲抗凍蛋白的熱滯值；鞏子路［37］同時(shí)評價(jià)了新疆冷水魚的抗凍蛋白活性的高低，也說明了通過DSC法測定抗凍蛋白的熱滯值具有良好的可重復(fù)性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；田童童等［38］通過DSC法檢測胡蘿卜的熱滯值，結(jié)果顯示，DSC法測定抗凍蛋白的熱滯值同樣具備良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性與精密度。

另外，在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，通過“冰親和純化”的技術(shù)，利用抗凍蛋白能吸附到冰上的性質(zhì)，可以在蛋白質(zhì)混合物中分離出抗凍蛋白。使用從植物提取物中收集的細(xì)胞裂解物，可以在黃銅探針上緩慢生長形成冰半球，使抗凍蛋白結(jié)合到冰結(jié)晶結(jié)構(gòu)中，然后使用splat法測試提取物的冰重結(jié)晶抑制活性。該方法可以回收活性蛋白質(zhì)，純化的蛋白質(zhì)可用于質(zhì)譜法鑒定肽序列和天然蛋白質(zhì)的生化分析，并且該測定只需要低的蛋白質(zhì)濃度就能產(chǎn)生快速檢測出抗凍蛋白的冰重結(jié)晶抑制活性［39］。

3 植物抗凍蛋白抗凍機(jī)理

植物抗凍蛋白是一類具備親水性的熱穩(wěn)定的冷誘導(dǎo)蛋白。北印第安納州研究所對16種被子植物和常綠植物檢測中發(fā)現(xiàn)，秋季和冬季均可檢測到抗凍蛋白，但是在夏季卻檢測不到［40］。這表示低溫脅迫是抗凍蛋白產(chǎn)生的條件，通過產(chǎn)生抗凍蛋白來提高植物對低溫的適應(yīng)性，因此它屬于低溫誘導(dǎo)蛋白。植物防凍活性的生物化學(xué)特征表明，它們的主要功能是抑制冰晶生長而不是降低冰凍溫度?？箖龅鞍椎臒釡?yīng)、冰晶形態(tài)效應(yīng)、重結(jié)晶抑制效應(yīng)表明，低溫條件下，抗凍蛋白直接參與冰晶的形成過程，從而直接保護(hù)植物免受低溫的脅迫，是一種直接調(diào)節(jié)方式，而增強(qiáng)細(xì)胞抗冰凍脫水能力的蛋白、通過調(diào)節(jié)酶活性、代謝或者穩(wěn)定細(xì)胞膜來應(yīng)對低溫脅迫的蛋白、與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的低溫誘導(dǎo)蛋白及低溫誘導(dǎo)的熱激蛋白和脫水蛋白7種類型［18，41］的蛋白都是通過間接的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。

植物的抗凍蛋白被認(rèn)為是雙功能蛋白質(zhì)［33］。一些抗凍蛋白與病程相關(guān)（Pathogenesis related，PR）蛋白同源而且同時(shí)具有防凍和水解活性。茉莉酸和乙烯在調(diào)控植物抗凍方面有重要作用，當(dāng)植物在非寒冷脅迫的條件下，施加乙烯和茉莉酸也會(huì)造成抗凍活性物質(zhì)的積累。因此推測它的作用機(jī)理如下：當(dāng)受到寒冷脅迫時(shí)，在質(zhì)外體中寒冷信號通過刺激鈣離子或者是對PR蛋白進(jìn)行翻譯后修飾（posttranslational modification，PTM），使其構(gòu)象改變并轉(zhuǎn)化為抗凍蛋白，可以防止冰晶的生長和嗜冷病原體的侵襲。同時(shí)，寒冷脅迫還會(huì)刺激細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng)。首先會(huì)刺激乙烯和茉莉酸的釋放，這些激素通過調(diào)控基因表達(dá)來使抗凍蛋白積累。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子（WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以防止細(xì)胞內(nèi)冰的形成）的表達(dá)也在冷脅迫時(shí)增加，這又調(diào)控了基因的表達(dá)，使抗凍蛋白積累。這些抗凍蛋白運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)外體中發(fā)揮作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子和脫水蛋白能抑制細(xì)胞內(nèi)冰核的形成，應(yīng)該是抑制細(xì)胞內(nèi)冰核形成劑從而防止細(xì)胞內(nèi)冰形成的細(xì)胞內(nèi)抗凍蛋白。那抗凍蛋白具體是怎么來發(fā)揮抗凍功能的呢。

不同的抗凍蛋白作用方式不同，抗凍蛋白是依靠結(jié)合在水冰交界面來抑制冰晶生成的，大概有以下幾種方式：第一吸附抑制學(xué)說，是1977年由Raymond等［31］提出抗凍蛋白吸附在冰生長的表面，因?yàn)榍试黾樱瑢?dǎo)致邊緣的表面積增加，由于表面張力的影響，增加表面積使其平衡狀態(tài)改變從而導(dǎo)致冰點(diǎn)降低。第二“偶極子—偶極子”學(xué)說，Yang等［42］認(rèn)為抗凍蛋白具備明顯平行于其螺旋軸親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的偶極子，偶極子與冰晶周圍水分子的偶極子相互作用，推動(dòng)抗凍蛋白與冰晶結(jié)合，阻止冰晶的生長。第三氫原子結(jié)合模型，即認(rèn)為抗凍蛋白分子可以分為疏水的一側(cè)和親水的一側(cè)，而與冰相互作用的是親水的一側(cè)，疏水的一側(cè)與水相互作用?？箖龅鞍追肿又械臍湓优c冰晶上的氧原子識(shí)別并結(jié)合，阻止了冰晶生長，從而發(fā)揮作用［18］。第四剛體能量學(xué)說，根據(jù)表面能最小原理，把抗凍蛋白看做小分子，抗凍蛋白與冰、水之間的表面能存在差別，使得抗凍蛋白能夠強(qiáng)烈的吸附冰晶［43］，從而發(fā)揮作用。第五即冰核抑制學(xué)說，即抗凍蛋白吸附于灰塵和冰核的表面，阻止了灰塵和冰核的聯(lián)合，從而抑制新的冰核的形成。因?yàn)楸耸潜纬傻幕A(chǔ)，因此沒有冰核的形成，就無法形成冰晶，從而抑制冰晶的形成，發(fā)揮抗凍功效［44］。以上是目前對抗凍蛋白發(fā)揮抗凍能力機(jī)理的5種學(xué)說。因?yàn)榭箖龅鞍追N類豐富，不同抗凍蛋白作用方式有所區(qū)別，可能還存在其他類型的抗凍蛋白和不同的作用機(jī)理，這都需要我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

4 植物抗凍蛋白研究進(jìn)展及應(yīng)用

迄今為止，已在60多個(gè)植物中檢測到抗凍蛋白，15種已被純化［33］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物抗凍蛋白的熱滯活性多數(shù)小于1℃，云杉的熱滯活性相對較高，達(dá)到2.19℃，與昆蟲和動(dòng)物抗凍蛋白相比低很多。不同種植物抗凍蛋白的同源性較低。有些植物的抗凍蛋白不僅具有抗凍活性，還具有其他功能，如樟子松（Scotch pine）的抗凍蛋白，屬于PR-10家族，還具有體外抗菌活性［45］。另外，抗凍蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)多存在糖基化現(xiàn)象，如沙冬青抗凍蛋白（基因序列號AY590122、AY843521和AY843522）、胡蘿卜抗凍蛋白（蛋白序列號A91926.1）和沙棘等的抗凍蛋白，通過糖基化以維持抗凍蛋白的穩(wěn)定。但是其中沙冬青抗凍蛋白凝集素有一些過敏原，目前轉(zhuǎn)基因不再應(yīng)用。對不同植物中抗凍蛋白的性質(zhì)、來源及同源性進(jìn)行了總結(jié)（表1），抗凍蛋白多定位于細(xì)胞的質(zhì)外體中，多數(shù)發(fā)現(xiàn)于植物的葉片、根和芽中，只有臘梅［Chimonanthus praecox（linn.）Link.］抗凍蛋白定位于花冠質(zhì)外體中和桃（Prunus persica）抗凍蛋白定位于樹皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；抗凍蛋白都有一定的熱穩(wěn)定性，熱滯活性大多在0.1-1.0，而女貞（Ligustrum lucidum）的抗凍蛋白熱滯活性較高，與魚類相似，可達(dá)2℃，云杉的抗凍蛋白熱滯活性也達(dá)到2.19℃，在植物抗凍蛋白的熱滯活性中明顯偏高，桃的抗凍蛋白熱滯活性較低，為0.06℃；不同來源的抗凍蛋白具有一定的同源性，無芒雀麥（Bromus inermisLeyss）、云杉、臘梅、野生香蕉（Musa rubinea）的抗凍蛋白均與幾丁質(zhì)酶同源，胡蘿卜和沙棘的抗凍蛋白與多聚半乳糖醛酸酶抑制劑蛋白同源，連翹（Forsythia suspensa）和桃的抗凍蛋白與脫水蛋白同源，黑麥草和女貞的抗凍蛋白與內(nèi)切殼多糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、奇異果甜蛋白和禾本科植物的抗凍蛋白同源，而沙冬青、小麥（Triticum aestivumL.）、茄子（Solanum melongenaL.）、冬油菜（Brassica campestrisL.）和樟子松的抗凍蛋白的同源性不明顯?？傊煌参锟箖龅鞍锥加胁煌箖龌钚?，并且抗凍蛋白的性質(zhì)也各有差異，同源性也有所不同。

為了提高植物的抗寒能力，科學(xué)家將抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入植物發(fā)現(xiàn)，不僅從植物中提取的抗凍蛋白基因經(jīng)轉(zhuǎn)化可以提高植物的抗寒能力，魚類和昆蟲的抗凍蛋白基因也能轉(zhuǎn)入植物，提升植物對低溫的適應(yīng)能力。因?yàn)橹参锟箖龅鞍谉釡蠡钚员若~類低，遠(yuǎn)小于昆蟲，而重結(jié)晶抑制活性比魚類和昆蟲高10-100倍［71］。因此，將昆蟲和植物抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入植物融合表達(dá)，對植物抗寒能力的提高有重要意義。如張振華等［72］將胡蘿卜和黃粉蟲抗凍蛋白基因融合，轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)黃粉蟲抗凍蛋白的高熱滯活性使得轉(zhuǎn)基因擬南芥的冰點(diǎn)降低，而具有高重結(jié)晶抑制活性的胡蘿卜抗凍蛋白使轉(zhuǎn)基因植株在較長時(shí)間的凍害條件下，穩(wěn)定質(zhì)外體中的流體，從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥在低溫下的損傷程度大大降低。陳佳佳［73］將矮沙冬青抗凍蛋白基因?qū)胗衩孜闯墒煊着咧?，將幼苗置?℃低溫脅迫下處理24 h，之后轉(zhuǎn)入室溫中解凍，發(fā)現(xiàn)對照組玉米的葉片失水萎蔫，而轉(zhuǎn)入抗凍蛋白的陽性植株葉片則表現(xiàn)正常，說明矮沙冬青抗凍蛋白基因在玉米中異源表達(dá)，顯著的提升了玉米的抗寒能力，為改善玉米作物品質(zhì)、提高產(chǎn)量提供了新思路。陳亮亮［74］將小胸鱉甲昆蟲抗凍蛋白基因Mpafp149轉(zhuǎn)入棉花中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花的脯氨酸含量轉(zhuǎn)基因植株通過產(chǎn)生脯氨酸來應(yīng)對低溫脅迫，在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因棉花的抗寒性。為了獲得抗寒能力高的植株，以提高農(nóng)作物產(chǎn)量，科學(xué)家們分別從昆蟲、魚類和植物中克隆了抗凍蛋白基因，轉(zhuǎn)入植物中，以期提高植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，昆蟲抗凍蛋白具有較高抗凍活性，已經(jīng)成為植物轉(zhuǎn)化研究中選擇的抗凍蛋白［75］。由表2可知，從昆蟲、魚類、植物中得到的抗凍蛋白基因及動(dòng)植物抗凍蛋白融合基因轉(zhuǎn)入受體植株后，轉(zhuǎn)基因植株都正常生長，并且都表現(xiàn)出一定的對低溫的適應(yīng)能力，表明外源抗凍蛋白基因可以使受體植株抗凍能力得到提升。為了提高農(nóng)作物抗寒能力以提高產(chǎn)量滿足需求，對抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)化進(jìn)行了深入研究（表2）。由于從沙冬青中獲得的抗凍蛋白雖然有效，但有些凝集素存在過敏源，因此目前在轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)不再應(yīng)用。

表1 不同植物中的抗凍蛋白

近年來，抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、冷食品儲(chǔ)藏加工和水產(chǎn)養(yǎng)殖［94］等方面應(yīng)用越來越廣泛。如在農(nóng)業(yè)方面［13］，通過種植導(dǎo)入抗凍蛋白基因的農(nóng)作物，農(nóng)作物抗寒水平大大增加，從而農(nóng)作物的種植時(shí)間變長，種植地域變廣，同時(shí)收獲之后農(nóng)作物的儲(chǔ)存時(shí)間也可以延長。在醫(yī)學(xué)方面［13，95］，抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)可以更好地保存血液、器官、胚胎、肝臟及精子和卵子，大大的提高了低溫保存中的質(zhì)量。在冷食品儲(chǔ)藏加工方面［13］，抗凍蛋白在冷凍面團(tuán)饅頭品質(zhì)的改善［96-97］、冷鮮肉和冰淇淋等加工和保鮮的過程中起到了很大的作用，在低溫條件下會(huì)阻止冰渣的產(chǎn)生，增加肉類和冰淇淋的口感，但迄今為止，還沒有可用的數(shù)據(jù)來報(bào)告毒性或挑戰(zhàn)這些“新型”食品成分的安全性［98］。研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)陽離子化的抗凍蛋白Ⅲ保留與天然抗凍蛋白Ⅲ類似的重結(jié)晶抑制活性，在零度以下的溫度對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有直接的負(fù)面影響。因此，化學(xué)陽離子化可能為開發(fā)更強(qiáng)大的抗凍蛋白提供條件，可以作為補(bǔ)充冷凍保護(hù)劑在臨床相關(guān)細(xì)胞的冷凍保存中應(yīng)用［99］。

表2 抗凍蛋白基因的轉(zhuǎn)化

5 結(jié)語

抗凍蛋白的研究正在繼續(xù)，熱滯效應(yīng)和抑制冰晶重結(jié)晶的作用機(jī)理都未完全了解，其中抗寒植物受到冷脅迫以后，大量的抗凍蛋白在胞內(nèi)累積，這些抗凍蛋白是如何受到調(diào)控而表達(dá)出來的，至今未知［100］。研究表明抗凍蛋白的表達(dá)包含鈣信號的調(diào)控。鈣和激素（如乙烯和茉莉酸）可以通過調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)，從而使抗凍蛋白累積［33］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以防止細(xì)胞內(nèi)冰的形成［33］。植物抗凍蛋白可以抑制嗜酸性細(xì)菌生長等等［33］。2011年，Walter等［100］在歐白英（Solanum dulcamaraLinn.）中確定顯示抗凍活性的非蛋白質(zhì)分子，而是糖脂。該糖脂產(chǎn)生的熱滯值和昆蟲抗凍蛋白的相近，為（3.1±0.4）℃，這是迄今為止在植物中檢測到的最高的熱滯活性。另外，抗凍蛋白的表達(dá)對于提高植物對低溫的適應(yīng)能力具有重要意義。在抗凍蛋白表達(dá)融合中，植物和昆蟲或植物和魚類抗凍蛋白的融合蛋白來提高植株抗凍能力具有更重要的價(jià)值，對于動(dòng)植物抗凍蛋白融合蛋白的研究具有廣闊的前景。但是對于植物抗凍機(jī)理方面的研究還不夠全面，或許還存在著其它未發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子或非蛋白質(zhì)分子也具備抗凍活性，需要進(jìn)一步研究探索。