黃穎，曹超，王軍，壽松濤

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診科，天津 300052）

膿毒癥指“機體對感染反應(yīng)失調(diào)所引起的危及生命的器官功能障礙”[1]。研究調(diào)查顯示，膿毒癥具有高發(fā)病率及高致死率的特點[2]，已成為現(xiàn)代危重病急救醫(yī)學(xué)面臨的世界性難題。膿毒癥發(fā)病機制非常復(fù)雜，免疫功能紊亂貫穿于膿毒癥病理過程的始終，宿主的免疫功能狀態(tài)在很大程度上決定著炎癥反應(yīng)的預(yù)后。Toll樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）可特異性識別革蘭氏陰性菌表面的內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS），而 LPS 是誘發(fā)膿毒癥感染主要的致病原。調(diào)節(jié)性T細胞是一類具有負向免疫調(diào)控作用的T細胞亞群，其功能及活性變化影響著膿毒癥免疫功能紊亂的預(yù)后[3-4]，但其作用機制尚不明確。本實驗通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)這一經(jīng)典術(shù)式復(fù)制膿毒癥模型，結(jié)合Treg在免疫功能障礙中的作用，探討TLR4在膿毒癥中對Treg功能及活性的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性健康SPF級C57/BL6小鼠 40只，C57BL/10ScNJNJ（TLR4-/-）小鼠 40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量約（20±2）g，均購于南京大學(xué)模式動物研究所，合格證號：scxk（蘇）2010-001。小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院動物實驗室，室溫20～25℃，相對濕度40%～50%，正常日光燈照射12 h維持晝夜循環(huán)，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無菌飼料喂養(yǎng)，正常進食，自由飲水。各組別用隨機數(shù)字表法將小鼠分為Sham組、CLP組、TLR4-/-Sham組、TLR4-/-CLP夜循環(huán)，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無菌飼料喂養(yǎng)，正常進食，自由飲水。各組別用隨機數(shù)字表法將小鼠分為Sham組、CLP組、TLR4-/-Sham組、TLR4-/-CLP組，各組別20只。

1.2 研究方法

1.2.1 造模 采用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation puncture，CLP）建立膿毒癥模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，取腹正中做1 cm切口，切開皮膚、腹肌、腹膜進腹，找到盲腸，將其輕輕拉出腹腔外，在盲腸中部結(jié)扎（結(jié)扎長度約1～1.5 cm），18G注射器針頭貫穿結(jié)扎遠端，擠出少量腸內(nèi)容物，以確保穿孔，將處理后的盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)后于皮下注射1 mL生理鹽水液體復(fù)蘇，Sham小鼠手術(shù)不予環(huán)形結(jié)扎及針刺穿孔，余與CLP組相同。

1.2.2 檢測Treg計數(shù)與凋亡率 術(shù)后24 h，分離小鼠脾淋巴細胞，加入10 μL Biotin抗體，混勻，4℃預(yù)冷孵育10 min，然后加入20 μL抗-Biotin抗體、10 μL CD25-PE抗體混勻，離心洗滌。PBS緩沖液重懸后，加10 μL抗-PE磁珠混勻，4℃避光預(yù)冷經(jīng)分選，收集流出CD4+CD25-Treg細胞，在含有5%CO237℃的孵育箱中孵育24 h后計數(shù)，加入Foxp3-FITC抗體（Bioscience）標(biāo)記，避光孵育30min，流式細胞儀檢測CD4+CD25-Treg凋亡。

1.2.3 檢測Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平 MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)分選各組CD4+CD25+Treg細胞，按Trizol試劑盒（美國Promega公司）操作說明，采用Trizol法提取總RNA并擴增，反轉(zhuǎn)錄（美國Promega公司）合成cDNA。采用熒光定量PCR儀進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 1 min，95℃變性 15 s，60℃退火/延伸 40 s，共40個循環(huán)。Foxp3上游引物：5′-CAGCTGCCTACA GTGCCCTAG-3′；下游引物：5′-CATTTGCCAGCAGT GGGTAG-3′；TLR4 上游引物：5′-TTTCACCTCTGC CTTCACTA-3′；下游引物：5′-AGATACACCAACGGC TCTGAAT-3′。分光光度儀檢測Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平。PCR引物購于伯研合眾（天津）生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.4 檢測Treg細胞的Foxp3、TLR4蛋白活性的表達 分離各組小鼠Treg，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，100 μL PBS重懸細胞，加入Anti-MouseCD152/CTLA-4-FITC 10 μL，4℃避光孵育后流式細胞儀檢測；用同樣的方法收集、洗滌、重懸Treg細胞。按Foxp3試劑盒操作說明將細胞破膜劑稀釋4倍，每106細胞加入固定/穿透工作溶液1 mL重懸，4℃避光孵育2h。破膜緩沖液洗1～2次，之后將細胞懸浮于200μLPBS中通過流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western Blot檢測 Treg 細胞內(nèi) NF-κB、p-NF-κB的水平 分離各組小鼠Treg，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，按照操作說明（Well-bio，上海）提取蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉，按說明書推薦比例稀釋抗體NF-κB、p-NF-κB，在4℃下過夜。用TBST洗膜后用辣根過氧化物酶孵育抗體（1:6 000，Bio-Rad，美國）。用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）（日本Millipore）對膜上的帶密度進行了掃描和分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組標(biāo)準(zhǔn)化的樣本數(shù)值用x±s，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Treg計數(shù)及凋亡率變化 由表1可見，與Sham組相比，WT CLP組及TLR4-/-CLP組Treg數(shù)量均增多（P＜0.05），但兩組中WT CLP組增多更明顯（P＜0.05）。與Sham組相比，WTCLP組Treg細胞凋亡率明顯下降（P＜0.05），而TLR4-/-CLP組較WTCLP組 Treg凋亡率升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠脾臟Treg計數(shù)及凋亡率Tab 1 Treg count and apoptosis rate in each group

2.2 Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平 由圖1可見，與WT Sham組相比，WT CLP組小鼠Treg細胞內(nèi)Foxp3mRNA及TLR4mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）。與 TLR4-/-Sham 組相比，TLR4-/-CLP 組Foxp3mRNA及TLR4mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05）。與 WTCLP 組相比，TLR4-/-CLP 組小鼠Foxp3mRNA及TLR4mRNA水平則顯著降低（P＜0.05）。

2.3 Treg細胞Foxp3、TLR4蛋白表達水平 如圖2所示，與WT Sham組相比，WTCLP組Treg細胞Foxp3及TLR4表達量明顯增加（P＜0.05）。與TLR4-/-Sham組相比，TLR4-/-CLP組Foxp3及TLR4的表達無明顯差異（P＞0.05）。與WTCLP 組相比，TLR4-/-CLP組Foxp3及TLR4表達量顯著減少（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠Treg細胞內(nèi)Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平Fig1 The expression of Foxp3mRNA and TLR4mRNA in Treg of each group

圖2 各組小鼠Treg細胞Foxp3、TLR4蛋白活性的表達水平Fig 2 TheexpressionofFoxp3andTLR4proteininTregofeachgroup

2.4 Treg細胞內(nèi) NF-κB、p-NF-κB水平 如圖 3所示，與WT Sham相比，WT CLP組小鼠脾臟的Treg細胞內(nèi)NF-κB和p-NF-κB表達量顯著升高（P＜0.05），與 TLR4-/-Sham 組，TLR4-/-CLP 組 NF-κB和 p-NF-κB 表達量較稍升高（P＜0.05）。而 TLR4-/-CLP組與WT CLP組比較，Treg細胞內(nèi)NF-κB和p-NF-κB 表達量明顯降低（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠Treg細胞內(nèi)p-NF-κB、NF-κB蛋白的表達水平Fig 3 The expression of p-NF-κB andNF-κB protein in Treg of each group

3 討論

膿毒癥是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)和感染后的嚴重并發(fā)癥之一，其病情進展可誘發(fā)膿毒癥休克和多器官功能衰竭，是ICU常見的致死原因[5-6]。在膿毒癥發(fā)病機制中，早期常表現(xiàn)為過度炎癥反應(yīng)，隨即機體進入持續(xù)的免疫抑制狀態(tài)，過度的炎癥反應(yīng)促使機體出現(xiàn)嚴重的免疫功能障礙，甚至出現(xiàn)免疫麻痹[7]，而因免疫麻痹導(dǎo)致的感染并發(fā)癥成為膿毒癥患者臨床死亡的主要原因[8-9]。本實驗采用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型，與人類膿毒癥特點相似，具有較高的相關(guān)性[10]。

TLR4屬于Toll樣受體家族，在多種類型的細胞均可得到表達，是天然免疫系統(tǒng)識別病原微生物的主要受體，不僅可特異性識別革蘭氏陰性菌表面的內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS），還能識別類脂A、熱休克蛋白60（HSP60）、真菌表面的多聚體（GXM）。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后24 h，野生型小鼠脾Treg細胞中TLR4表達顯著升高，且TregFoxp3mRNA及其蛋白表達亦明顯升高，但Treg自身凋亡率顯著減少，提示此時Treg功能及活性顯著增強。而TLR4-/-鼠中，Treg自身凋亡率及Foxp3表達（mRNA和蛋白）未見顯著變化，這表明膿毒癥狀態(tài)下Treg功能及活性的變化與TLR4表達密切相關(guān)，這與Yang[11]及Huss[12]等的研究結(jié)果一致。

本研究進一步對作用機制進行了初步探討。TLR4作為LPS的受體，在膿毒癥時兩者結(jié)合，通過MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑通過激活NF-κB[13-19]。NF-κB在幾乎所有類型細胞中均存在表達。有研究表明，在膿毒癥時，阻斷TLR4/NF-κB信號通路炎癥因子水平下降[20-21]。結(jié)果表明，CLP后24 h，在野生型鼠中Treg細胞中NF-κB和p-NF-κB表達顯著升高，而TLR4-/-時蛋白表達未見顯著變化，這提示膿毒癥時Treg細胞功能及活性的變化與TLR4/NF-κB信號通路密切相關(guān)，但具體分子機制仍有待于進一步研究。在我們的實驗結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，TLR4-/-CLP 組 Treg細胞 NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達量較TLR4-/-Sham組輕度增加，此結(jié)果可能與膿毒癥病理過程復(fù)雜，多條信號通路參與其發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，擬下一步對該結(jié)果進行研究分析。

膿毒癥病理機制極其復(fù)雜，涉及多條信號通路及多種作用機制，本研究僅探討其中一條信號通路，且對象為動物模型，尚需進一步研究探索后應(yīng)用于臨床治療，本研究旨在為臨床治療膿毒癥提供新的方向與理論依據(jù)。