張悅，管敘文，王婧雅，黃鼎智

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060）

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤第二位[1]。雖然胃癌治療方式有一定進展，但預(yù)后并沒有得到相應(yīng)的改善。近年來，腫瘤治療進入了靶向治療新時代，隨著對胃癌發(fā)生、發(fā)展分子機制的深入探索，靶向藥物在胃癌中的應(yīng)用逐漸增多[2]，但尚未有突破性的結(jié)果，因此尋找新的治療靶點具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一種小分子非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA分子 3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）結(jié)合而影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。miR-27a位于人19號染色體上，屬于miRNA-23a-24-27a簇，已證實在腎細胞癌、肝細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡、分化等病理生理過程[3-6]。有文獻報道m(xù)iR-27a在胃腺癌中高表達，并通過與抑制素基因靶向結(jié)合而抑制胃癌細胞生長[7]。筆者前期的研究表明miR-27a在胃癌中表達顯著上調(diào)，進一步的預(yù)后分析顯示miR-27a高表達者預(yù)后欠佳[8-9]。以上研究結(jié)果提示miR-27a在胃癌中可能發(fā)揮了癌基因的作用。叉頭框蛋白O1（forkhead box transcription factors O 1，F(xiàn)OXO1）是FOXO家族中研究較為成熟的一員，在腫瘤或其他疾病中發(fā)揮了重要的作用。研究表明，F(xiàn)OXO1在一些腫瘤中可作為miRNA的靶基因，如在乳腺癌中，miR-27a、miR-182及miR-96可以協(xié)同靶向抑制FOXO1表達，進而促進了細胞增殖并參與了細胞周期轉(zhuǎn)換[10]。在肺癌中，miR-411通過沉默F(xiàn)OXO1表達促進肺癌細胞增殖[11]?；谏鲜鲅芯勘尘?，本實驗旨在探討miR-27a對胃癌細胞株SGC-7901的凋亡作用，同時研究敲低FOXO1對胃癌細胞凋亡的影響，并對miR-27a與FOXO1的關(guān)系進行驗證與分析，以期為胃癌治療新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株SGC-7901購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞資源中心；Trizol Reagent，lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司；SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit購自大連寶生物公司；miR-27a mimics質(zhì)粒、miR-27a mimics對照質(zhì)粒、miR-27a inhibitors質(zhì)粒、miR-27a inhibitors對照質(zhì)粒、si-FOXO1質(zhì)粒及si-FOXO1對照質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司；FOXO1一抗購自美國Abcam公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；報告基因質(zhì)粒購自美國Progada公司；細胞凋亡Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SGC-7901細胞培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。取生長狀態(tài)良好的細胞，于轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種于培養(yǎng)皿中，按照說明書用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-27a mimics質(zhì)粒，miR-27a mimics對照質(zhì)粒，miR-27a inhibitors質(zhì)粒，miR-27a inhibitors對照質(zhì)粒，si-FOXO1質(zhì)粒及si-FOXO1對照質(zhì)粒，細胞培養(yǎng)24～48 h后進行后續(xù)的實驗。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率-Annexin V/PI雙染色法 收集胃癌細胞SGC-7901到10 mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為3×106/mL，1 000 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min。用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞,孵育緩沖液洗1次。加入Annexin V-FITC/PI溶液，4℃下孵育20 min。最后補400 μL PBS，隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。加入Annexin V-FITC/PI溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動。隨即進行流式細胞儀分析，流式細胞儀激發(fā)光波長488 nm，用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，用波長大于560 nm的濾器檢測PI。凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則無此特性。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。

1.2.3 Western blot檢測 p53、BCL-2、LC3I、LC3II及FOXO1蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后48 h的SGC-7901細胞，加入RIPA細胞裂解液后離心收集SGC-7901細胞中總蛋白，經(jīng)10%-15%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，4℃、5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBS-T洗去一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBS-T洗滌3次，ECL試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因試驗 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果得到miR-27a的潛在靶基因FOXO1，同時得到miR-27a在FOXO1基因3′UTR中結(jié)合位點，將含有靶位點的3′UTR序列及突變型3′UTR序列進行全基因合成，然后將目的序列構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體,將miR-27a表達質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染或者與熒光素報告載體共轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞。轉(zhuǎn)染后48 h以酶標(biāo)儀檢測熒光素酶的活性。

1.2.5 RNA的提取及Real-time PCR檢測 采用Trizol試劑提取SGC-7901細胞總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。根據(jù)SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit試劑盒說明書加入500 ng的總RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需試劑。得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用相應(yīng)的PCR引物在定量PCR儀進行實時定量PCR。PCR條件為95℃5 s，60℃34 s，進行40個循環(huán)。miR-27a PCR引物序列上游：5′-CGGCGGTT TCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-CCAGTGCAGG GTCC GAGGTAT-3′；FOXO1 基因引物序列上游 5′-TGGACATGCTCAGCAGACATC-3′，下游：5′-TTGG GTCAGGCGGTTCA-3′；β-actin基因引物序列上游：5′-ACACCTTCTACAATGA GCTG-3′，下游：5′-CAT GATGGAGTTGAAGGTAG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)都至少來自3組獨立的實驗。數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件，計量資料用x±s表示，所有統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)miR-27a及敲低FOXO1對胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡的影響 Annexin V/PI雙染色法可以區(qū)分不同凋亡時期的細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左上象限表示機械損傷細胞（Annexin-FITC-/PI+）；左下象限顯示正?；罴毎ˋnnexin-FITC-/PI-）；右上象限是凋亡中晚期細胞（Annexin-FITC+/PI+）；右下象限為早期凋亡細胞（Annexin-FITC+/PI-)。凋亡率為右上象限與右下象限細胞占總細胞數(shù)的比例。實驗結(jié)果如圖1A，miR-27a過表達組及其對照組細胞凋亡率分別為16%、29%，表明miR-27a過表達可顯著抑制SGC-7901細胞凋亡（P＜0.05）。而如圖1B所示，F(xiàn)OXO1低表達組及其對照組細胞凋亡率分別為5%、10%，表明FOXO1低表達亦顯著抑制SGC-7901細胞凋亡（P＜0.05）。

圖1 上調(diào)miR-27a或敲低FOXO1抑制胃癌細胞凋亡Fig 1 Over-expression of miR-27a or low-expression of FOXO1 inhibited gastric cancer cell apoptosis

2.2 上調(diào) miR-27a及敲低FOXO1對胃癌細胞SGC-7901 p53、BCL-2、LC3I及 LC3II的表達水平的影響 Westernblot檢測結(jié)果顯示，敲低FOXO1組，F(xiàn)OXO1蛋白表達較對照組下調(diào)（P＜0.05）；相對各自的對照組，上調(diào)miR-27a組及si-FOXO1組凋亡相關(guān)蛋白p53表達水平下降，BCL-2表達上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白 LC3I、LC3II表達下降（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 上調(diào) miR-27a及敲低 FOXO1后 p53、BCL-2、LC3I、LC3II蛋白表達變化Fig2 Changes in expression of p53,BCL-2,LC3I and LC3II in miR-27a over-expression and FOXO1 low-expression

2.3 miR-27a靶基因的驗證 通過生物信息學(xué)方法，用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDB及miRanda網(wǎng)站預(yù)測miRNA-27a的靶基因,獲得潛在的靶點FOXO1。Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示miR-27a高表達質(zhì)粒、miR-27a低表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細胞后miR-27a水平分別上調(diào)、下調(diào)，表明了miR-27a高表達質(zhì)粒、miR-27a低表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因驗證，結(jié)果顯示，在野生型FOXO1 3′UTR組，miR-27a高表達組的熒光素酶活性比相應(yīng)的對照組低，miR-27a低表達組的熒光素酶活性則比相應(yīng)的對照組高（P＜0.05）。而在突變型FOXO1 3′UTR組，miR-27a高表達或低表達后熒光素酶活性與對照組相比并沒有明顯變化（P＜0.05）（圖 3）。

圖3 驗證miR-27a與FOXO1之間的靶點關(guān)系Fig 3 Verification of target relationship between miR-27aand FOXO1

2.4 miR-27a對胃癌細胞SGC-7901中FOXO1表達的影響 Realtime PCR結(jié)果顯示，相對于各自對照組，上調(diào)或下調(diào)miR-27a后，SGC-7901細胞中FOXO1 mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-27a mimic組細胞中FOXO1蛋白水平較其對照組低（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-27a inhibitor組細胞中FOXO1蛋白水平較其相應(yīng)對照組高（P＜0.05）（圖 4）。

圖4 miR-27a在蛋白水平上負性調(diào)控FOXO1的表達Fig 4 miR-27a negatively regulated the protein expression of FOXO1

3 討論

近年來，miRNA在人類腫瘤研究領(lǐng)域獲得較多關(guān)注。miRNA是一種非編碼短鏈RNA，通過與靶基因mRNA 3′UTR完全或不完全堿基互補配對，促進靶基因mRNA的降解或抑制靶基因的翻譯，發(fā)揮了癌基因或抑癌基因的功能。目前miR-27a在胃癌中的體內(nèi)外研究多集中于其對腫瘤細胞增殖、侵襲遷移能力及細胞周期阻滯的影響，而針對細胞凋亡的研究尚屬空白。因而本研究對miR-27a在胃癌細胞凋亡中的作用及作用機制進行了初步探索。

細胞凋亡是由基因控制的程序化細胞主動死亡，在調(diào)節(jié)機體正常發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞存在凋亡逃逸，從而獲得了無限增殖的能力。本研究對轉(zhuǎn)染miR-27a過表達質(zhì)粒的中分化人胃腺癌SGC-7901細胞株的凋亡情況進行了研究，結(jié)果顯示，在胃癌細胞中miR-27a過表達可以顯著抑制細胞凋亡，提示miR-27a在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了癌基因的作用并可作為潛在的胃癌治療新靶點。

FOXO是FOX家族中的O亞族，是生理及病理狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，由FOXO1、FOXO3、FOXO4及FOXO6組成，4個成員各自發(fā)揮著不同的功能[12]。研究表明FOXO1在乳腺癌、肺癌、原發(fā)性肝癌、骨肉瘤等腫瘤中呈低表達，可通過調(diào)控下游的腫瘤相關(guān)基因的表達而參與細胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等過程，發(fā)揮著抑癌基因的功能[10，13-14]。Reagan-Shaw等發(fā)現(xiàn)抑制乳腺癌細胞中PI3K表達后，F(xiàn)OXO1表達上調(diào)，進而促進了細胞凋亡和導(dǎo)致細胞周期阻滯[15]。本研究中敲低SGC-7901細胞中FOXO1表達后得到了與轉(zhuǎn)染miR-27a mimics類似的實驗結(jié)果，即FOXO1表達下調(diào)抑制胃癌細胞凋亡。提示FOXO1可以為胃癌治療提供新的方向。

通過生物信息學(xué)方法得到miR-27a潛在的靶點FOXO1，目前研究亦提示在一些腫瘤中miR-27a與FOXO1存在靶點關(guān)系[10，15]。本研究應(yīng)用雙熒光素酶報告基因進行了驗證，結(jié)果表明pre-miR-27a前體能夠顯著降低野生型FOXO1 3′UTR組質(zhì)粒的熒光活性，而對突變型FOXO1 3′UTR組質(zhì)粒沒有影響，最終證實了FOXO1是胃癌SGC-7901細胞中miR-27a的靶基因。進一步研究顯示上調(diào)/下調(diào)miR-27a后，SGC-7901細胞中FOXO1mRNA水平無明顯變化，F(xiàn)OXO1蛋白水平相應(yīng)下調(diào)/上調(diào)，這提示miR-27a能夠在蛋白翻譯水平負性調(diào)控FOXO1蛋白的表達。由此推斷：mi-R27a通過抑制靶基因FOXO1的表達抑制胃癌細胞凋亡。

BCL-2是細胞凋亡相關(guān)研究中研究最多的一種抗凋亡蛋白。而p53蛋白是重要的細胞凋亡調(diào)控因子，可以監(jiān)視DNA損傷及誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞增殖。據(jù)文獻報道BCL-2能夠抑制p53介導(dǎo)的凋亡[16]。本研究應(yīng)用Western blot法對上調(diào)miR-27a/敲低FOXO1的胃癌細胞中BCL-2及p53水平進行檢測，結(jié)果顯示BCL-2表達上調(diào)，p53表達下降，由此進一步印證了miR-27a抑制胃癌細胞凋亡及FOXO1促進細胞凋亡的結(jié)論。同時可以推斷，BCL-2通過抑制p53的表達參與了miR-27a/FOXO1軸對胃癌細胞凋亡的影響過程，進而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，但其中的作用機制尚需深入研究。

腫瘤細胞受細胞程序性死亡的調(diào)控，而凋亡和自噬是程序性死亡的兩種形式，且凋亡和自噬有著密切的關(guān)系。有文獻報道，葡萄籽原花青素可以通過調(diào)控ROS表達而誘導(dǎo)凋亡和自噬，當(dāng)加入3-MA抑制自噬時,葡萄籽原花青素誘導(dǎo)細胞凋亡的能力下降，表明了自噬可以促進凋亡[17]。本研究對上調(diào)miR-27a/敲低FOXO1的胃癌細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II進行檢測，結(jié)果表明 LC3I、LC3II表達下降，由此我們可初步推斷miR-27a過表達及si-FOXO1可以抑制自噬而抑制胃癌細胞凋亡，從而在胃癌的進展過程中發(fā)揮重要作用。

由于胃癌早期篩查及診斷率低，多數(shù)胃癌患者在被確診時已為晚期，化療為主要治療手段，但因原發(fā)或獲得性耐藥的出現(xiàn)，胃癌治療陷入瓶頸。由于胃癌具體的發(fā)病機制未被闡明，故尚無良好的靶點。本研究分析了miR-27a對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響及其作用機制，初步得出了mi-R27a可通過靶向抑制FOXO1的表達抑制胃癌細胞凋亡的結(jié)論，這提示mi-27a/FOXO1軸可以作為胃癌治療的新靶點。