王德佳 楊 波

(承德市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

帕金森病(PD)是一種常見的中老年人神經(jīng)變性疾病，主要臨床表現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)障礙、靜止性震顫和肌強(qiáng)直等。PD的發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境、老齡化、免疫學(xué)異常和氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，其主要病變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺(DA)神經(jīng)元選擇性缺失或變形，導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡或神經(jīng)膠質(zhì)增生等〔1～3〕。激活小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致如腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種炎癥因子的釋放，引起DA能神經(jīng)元損傷〔4〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，PD發(fā)病機(jī)制可能與線粒體功能異常、DA氧化產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物和細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制還不明確。核苷酸寡聚結(jié)合域蛋白(NOD)是一種NOD樣受體，在多種免疫和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。NOD2是NOD樣受體家族中研究的熱點(diǎn)〔5，6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2基因可能在PD的發(fā)生中起重要作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)以神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP) 制備PD小鼠模型，通過(guò)觀察NOD2基因敲除小鼠中黑質(zhì)細(xì)胞凋亡情況和DA能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目、TNF-α蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)DA含量、DA代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)含量的變化，探討NOD2基因?qū)D黑質(zhì)DA神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠20只，鼠齡6 w，體重18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。NOD2基因敲除小鼠20只，購(gòu)于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。β-肌動(dòng)蛋白(actin)鼠源單抗、鼠抗TNF-α單抗、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2單抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-二抗均購(gòu)于北京博奧森生物有限公司。MPTP、DA和HVA對(duì)照品均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)總蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京碧云天生物有限公司。色譜柱為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。注射器為鎮(zhèn)江康利醫(yī)藥器械有限公司產(chǎn)品，電泳儀為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物模型制備及分組 取健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和PD模型組。NOD2基因敲除小鼠隨機(jī)分為NOD2對(duì)照組和NOD2組。PD模型組：每日上午7時(shí)腹腔注射MPTP，共注射14 d。對(duì)照組：每日上午7時(shí)腹腔注射與MPTP等量的生理鹽水，共注射14 d。NOD2組：每日上午7時(shí)腹腔注射MPTP，共注射14 d。NOD2對(duì)照組：每日上午7時(shí)腹腔注射與MPTP等量的生理鹽水，共注射14 d。每次注射藥物后觀察小鼠的變化。

1.3行為學(xué)檢驗(yàn) 建模14 d時(shí)，腹腔注射濃度為0.5 mg/ml的阿撲嗎啡，于一封閉的圓形空間內(nèi)，觀察各組小鼠的旋轉(zhuǎn)行為。每只小鼠每次檢驗(yàn)記錄時(shí)間為30 min。

1.4組織切片的制備 每組各取5只小鼠，用2%戊巴比妥鈉溶液深度麻醉，注射MPTP 14 d后的各組小鼠，處死并取出整個(gè)腦部，于冰上迅速分離出黑質(zhì)(-80℃下保存)，置于固定液(含4%多聚甲醛)中固定24 h(4℃)，經(jīng)蔗糖溶液常規(guī)脫水，包埋，切片。切片厚度8 μm。每只取4個(gè)相同切片斷面進(jìn)行TH免疫組化染色。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TH免疫組織化學(xué)染色。置于顯微鏡下觀察黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。

1.5黑質(zhì)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取1.4中制備的各組組織切片，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行常規(guī)脫水、透明和封片。隨機(jī)選取5個(gè)視野于高倍鏡下觀察。

1.6Western印跡檢測(cè) 取適量黑質(zhì)組織，加蛋白裂解液，于冰上充分研磨至勻漿，離心，取上清，于-80℃保存。采用BCA法檢測(cè)提取總蛋白的濃度。將上樣緩沖液和蛋白樣品(1∶4)充分混合，于100℃下煮沸變性5 min。以每孔30 μg蛋白樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。常溫下5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入鼠抗人β-actin、Bcl-2、酶切Caspase-3(1∶200倍稀釋)和TNF-α抗體(1∶500倍稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，再與HRP-山羊抗兔IgG(1∶1 000倍稀釋)37 ℃下孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad系統(tǒng)掃描分析目的蛋白的表達(dá)量。以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7高效液相色譜熒光法測(cè)定DA和HVA含量 將剩余的每組5只小鼠，斷頸處死后，分離黑質(zhì)，加甲酸，研磨成漿，在冰上裂解30 min，離心取上清。采用高效液相色譜法檢測(cè)，流動(dòng)相為水(A)：甲醇(B)，流速為0.4 ml/min。柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。洗脫條件：0～4 min，5%(B)；4～10 min 5%→80%(B)；10～13 min 80%(B)；13～20 min 5%(B)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)DA和HVA的含量。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果 注射MPTP 14 d后，與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組〔(0.05±0.03)、(0.03±0.01)次/min〕相比，PD模型組〔(9.88±2.05)次/min〕和NOD2組〔(5.65±1.12)次/min〕均發(fā)生不同程度的旋轉(zhuǎn)(t=8.299、8.644，均P=0.001)；且PD模型組旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著高于NOD2組(t=3.159,P=0.034)。

2.2各組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Bcl-2蛋白表達(dá)量及酶切Caspase-3比較 TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多(t=12.546、6.703，P=0.000、0.003)，但NOD2組明顯少于PD模型組(t=4.983，P=0.008)。與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組Bcl-2蛋白表達(dá)量均明顯下降(t=21.228、7.621，P=0.000、0.002)，但NOD2組明顯高于PD模型組(t=19.215,P=0.000)。與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組酶切Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高(t=26.885、8.573，P=0.000、0.001)，但NOD2組顯著低于PD模型組(t=13.856,P=0.000)。NOD2對(duì)照組與對(duì)照組相比，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Bcl-2蛋白表達(dá)量和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.336、1.082、1.643，P=0.754、0.340、0.176)。見表1。

表1 NOD2基因敲除對(duì)黑質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

1)與對(duì)照組比較，2)與NOD2對(duì)照組比較，3)與PD模型組比較：均P<0.05；下表同

2.3各組TH陽(yáng)性神經(jīng)元、DA和HVA比較 免疫熒光染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量均顯著降低(t=8.879、3.846，P=0.001、0.018)，但NOD2組明顯高于PD模型組(t=5.531,P=0.005)。高效液相色譜熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組中DA含量均顯著降低(t=18.573、8.509,P=0.000、0.001)，但NOD2組顯著高于PD模型組(t=15.595,P=0.000)。與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組相比，PD模型組和NOD2組中HVA均顯著降低(t=6.758、3.621,P=0.003、0.022)，但NOD2組顯著高于PD模型組(t=5.720,P=0.005)；與對(duì)照組相比，NOD2對(duì)照組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、DA和HVA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.492、0.485、0.786，P=0.648、0.653、0.476)，見表2。

表2 各組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、DA和HVA比較

2.4各組TNF-α蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組和NOD2對(duì)照組(0.52±0.03、0.48±0.05)相比，PD模型組和NOD2組TNF-α蛋白表達(dá)量(1.38±0.21、0.86±0.15)均明顯升高(t=7.022、4.163，P=0.002、0.014)，但NOD2組明顯低于PD模型組(t=3.490,P=0.025)。NOD2對(duì)照組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.188,P=0.301)。

3 討 論

研究表明，細(xì)胞凋亡可能與PD發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而細(xì)胞凋亡是多種基因共同調(diào)控的結(jié)果〔8～10〕。與細(xì)胞凋亡基因相關(guān)的蛋白很多，如Bcl-2家族和Caspase家族蛋白等。其中，Bcl-2是一種抑凋亡蛋白，通過(guò)改變線粒體膜的通透性阻止細(xì)胞凋亡。Xu等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在早期的PD大鼠中，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，發(fā)揮抗凋亡作用可能參與PD的早期階段。

Caspase是一種半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，受刺激后形成Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凋亡執(zhí)行因子，正常情況下，以酶原形式存在，而活化后的酶切Caspase-3致不可逆性細(xì)胞凋亡。Shukla等〔12〕研究熱休克蛋白對(duì)PD果蠅模型的作用實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白能夠影響JNK和Caspase-3介導(dǎo)的DA能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。NOD2通過(guò)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的裂解產(chǎn)物胞壁酰二肽，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。Yoon等〔13〕發(fā)現(xiàn)活化的NOD2能夠誘導(dǎo)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前，關(guān)于NOD2基因在PD中的作用機(jī)制尚不清晰，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除NOD2基因可明顯抑制MPTP引起的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、酶切Caspase-3蛋白升高和Bcl-2蛋白的下降。提示NOD2基因敲除可減輕黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的調(diào)亡，減少腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的缺失，進(jìn)而對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

大量研究顯示，PD可能與炎癥密切相關(guān)，炎癥過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量活性物質(zhì)如TNF-α等，引起DA能神經(jīng)元死亡〔14～16〕。NOD2參與細(xì)胞內(nèi)病原微生物的識(shí)別和炎癥應(yīng)答，通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路，在炎癥穩(wěn)態(tài)和多種病理過(guò)程發(fā)揮重要作用。Du等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，NOD2在糖尿病患者腎臟的活組織和高脂飲食、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中表達(dá)上調(diào)，NOD2基因敲除使糖尿病晚期糖基化終末產(chǎn)物、TNF-α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受到影響，進(jìn)而改善糖尿病小鼠腎損傷。Bai等〔18〕通過(guò)建立腦缺血大鼠模型，下調(diào)NOD2后，通過(guò)對(duì)受體相互作用蛋白(RIP)2、核因子(NF)-κB和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的調(diào)控在腦缺血神經(jīng)功能損傷過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2基因可能在PD的發(fā)生中起重要作用〔7〕。本文結(jié)果提示，NOD2基因敲除對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。

綜上，NOD2基因敲除通過(guò)抑制注射MPTP引起凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、酶切Caspase-3蛋白和TNF-α蛋白表達(dá)升高及減輕注射MPTP引起的Bcl-2蛋白、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、DA含量和HVA含量下降，對(duì)PD小鼠DA神經(jīng)元起保護(hù)作用，為PD的治療提供了新思路。