詹麗娥　陸冰洋　劉華棟　李婷婷　唐娟　王彩先　丁樹榮

摘要：將疑似新城疫病料無菌采集后進(jìn)行RT-PCR鑒定，將陽性病料研磨后接種SPF雞胚，收獲的陽性尿囊液進(jìn)行血凝試驗（HA）及血凝抑制試驗（H1）檢測病毒效價，病毒效價達(dá)到2⁷～2⁸，病毒凝集效價達(dá)到10log2。使用10%蔗糖溶液及18-25kDa透析袋對陽性尿囊液進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的1/5；10%福爾馬林滅活診斷抗原，經(jīng)過6h后滅活達(dá)100%；診斷抗原效價測定：血凝效價為2¹⁰；血凝抑制效價為10log2。利用制備的雞新城疫診斷抗原和雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原與雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)檢測抗體進(jìn)行血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HI），對比結(jié)果：雞新城疫診斷抗原病毒效價為2¹⁰，高于雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原的2。，雞新城疫診斷抗原凝集效價為10log2，等同于雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原，證明所制備雞新城疫診斷抗原符合要求，可以應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。

關(guān)鍵詞：新城疫，RT-PCR，抗原檢測，抗原制備，抗體檢測

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。病雞是本病的主要傳染源，感染后臨床癥狀主要表現(xiàn)為：呼吸困難，拉綠色稀便，精神沉郁，個別出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈的神經(jīng)癥狀。病毒存在于病雞所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。在流行間歇期的帶毒雞也是本病的傳染源，病毒可經(jīng)消化道、呼吸道、眼結(jié)膜、受傷的皮膚和泄殖腔黏膜侵入機(jī)體。該病一年四季均可發(fā)生，以春秋季較多，雞群一旦發(fā)生本病可于4-5d內(nèi)波及全群，具有極高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類疫病，我國列入重大傳染病，也是禽類重點(diǎn)防控的傳染病之一。

目前對雞城新城的主要防控措施有以下幾種：1）新城疫疫苗預(yù)防，我國已將新城疫的免疫列入各養(yǎng)雞場的免疫程序；2）采取分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，將易感雞提前撲殺，控制易感雞群感染?？梢钥焖?、簡便診斷新城疫，易于基層獸醫(yī)站工作人員和雞場化驗員掌握，血凝試驗和血凝抑制試驗均需要新城疫診斷抗原，本項目對新城疫診斷抗原的制備方法進(jìn)行研究，采用血清學(xué)方法對雞群進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，達(dá)到了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療控制NDV傳播與流行的目的。

1.材料和方法

1.1病料

新城疫病料組織無菌采自山西太原、晉中、呂梁等地疑似發(fā)病雞場。

1.2主要試劑及材料

新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；dNTP（2.5mmol/Leach）、AMV、RNaseInhibitor、6^*Ioadinq Buffer、RT-PCRKit購自寶生物工程（大連）有限公司；Trizol購自Invitrogen公司引物由華大基因公司合成；即用型透析袋18-25kDa RC膜S/P購自美國光譜醫(yī)學(xué)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗動物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器

4℃冷凍離心機(jī)（型號為Neofuge 13R），購自HealForce公司；分光光度計（型號為BioPhotometer），購自Eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋（型號為HHS型），購自天津市華北實(shí)驗儀器有限公司；BIOER基因擴(kuò)增儀（型號為G1000），購自杭州博日科技有限公司；電泳儀（型號為GEI00），購自MiniRun公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號為Imageouant300），購自GE Healthcare公司；超凈臺，購自北京半導(dǎo)體一廠。

1.4引物設(shè)計與合成

參考新城疫診斷技術(shù)GB/T16550-2008中RT-PCR通用引物，引物序列（表1）：

1.5病料的處理

將采集到的16份疑似新城疫病料按OIE手冊中診斷與疫苗標(biāo)準(zhǔn)部分關(guān)于新城疫病毒處理的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，具體方法為：將凍存的病料融化后剪碎，放入研磨器中，加入滅菌PBS研磨并加入青鏈霉素終濃度為1mg/mL，得到的懸濁液加入等體積氯仿，充分震蕩后置于4℃過夜，12，000rpm離心15min將上清移入滅菌的EP管中備用。

1.6疑似病料RNA的提取及RT-PCR檢測

分別取1.4處理后的上清液100μL于EP管內(nèi)，加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min；將液體吸入吸附柱中，13，000rpm離心30s；棄去收集管中液體，加入600μL洗液，13，000rpm離心30s，重復(fù)該步驟一次；棄去收集管中液體，13，000rpm空柱離心2min；將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入洗脫液50μL，室溫靜置1min，13，000rpm離心30s，離心管中液體即為模板RNA。

RT-PCR總體積為20μL，加入16.8μL RT-PCR反應(yīng)液，1.2μL酶混合液，加提取的RNA2μL。反應(yīng)條件：42℃45min，94℃3min；循環(huán)94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

1.7SPF雞胚培養(yǎng)

將1.4中處理后的陽性病料上清液100μL超凈臺無菌接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，37℃培養(yǎng)24h后將死亡SPF雞胚取出，72h后無菌取尿囊液，連傳三代。

1.8陽性病料PCR檢測

參照RNA常規(guī)提取方法，取1.7中陽性病毒樣品250μL，加Trizol 750μL，劇烈振蕩15s，靜置5min；加500μL氯仿，混勻，靜置5min，4℃、12，000r/min離心15min；取上清液加等體積異丙醇，混勻，液氮沉降20min，取出室溫融化后，4℃、12，000r/min離心20min；棄上清液，加-20℃75%乙醇1mL，靜置15s，倒掉，重復(fù)一次；超凈臺風(fēng)干后，加20μL DEPC水溶解RNA，分光光度計檢測RNA含量，-80℃保存，備用。

RT-PCR反應(yīng)體系（表2）。

反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄42℃45min；預(yù)變性95℃3a‘iR；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個循環(huán)；終延伸72℃10min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

1.9病毒效價檢測與凝集價檢測

通過血凝試驗（HA）檢測新城疫病毒效價：取96孔板，每孔加50μL PBS；第——孔加50μL陽性尿囊液混勻，抽取第一孔50μL混合液加入第二孔，依次將陽性尿囊液進(jìn)行2^-1～2^-12稀釋，第十二孔混勻后棄去50μL；然后在每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞，震蕩器震蕩1min混勻，放入37℃恒溫箱20min進(jìn)行反應(yīng)。

通過血凝抑制試驗（H1）檢測新城疫病毒凝集價：根據(jù)1.9血凝試驗結(jié)果，將新城疫陽性尿囊液按照血凝滴度配制成4個血凝單位抗原；取96孔板，在第1～11孔加入0.025μL PBS，第12孔加入0.05μL PBS；在第1孔加入0.025μL標(biāo)準(zhǔn)陽性血清混勻，然后從第1孔吸出0.025μL液體加入第2孔，依次加至第10孔，第11孔為陽性對照，第12孔為陰性PBS對照；在第1～11孔加入0.025μL 4HAU抗原；每孔加入0.025μL 1%雞血細(xì)胞懸液，震蕩混勻，放37℃恒溫箱20min后，當(dāng)PBS對照孔紅細(xì)胞呈明顯紐扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。

1.10陽性診斷抗原濃縮與滅活

取SPF雞胚繁殖病毒陽性尿囊液50mL加入透吸袋里，透吸袋兩頭用醫(yī)用止血鉗挾住，將500mL10%的蔗糖溶液倒入搪瓷盤里鋪開，放入裝有50mL病毒尿囊液的透吸袋，根據(jù)滲透壓差的方向，10%的蔗糖溶液將水分從50mL病毒尿囊液透析袋里析出，當(dāng)透析袋里的陽性病毒尿囊液體積達(dá)到10-15mL即可停止?jié)饪s；用移液槍將透析袋里的陽性病毒尿囊液吸入無菌瓶里，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

濃縮的陽性病毒尿囊液用10%福爾馬林滅活，100mL陽性病毒尿囊液中加入0.2mL福爾馬林搖勻，1h后放入20℃?zhèn)溆?。取滅活后的陽性病毒尿囊液接種9日齡SPF雞胚，72h后收尿囊液進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行RT-PCR，方法如1.8。

1.11濃縮陽性診斷抗原效價測定

參考新城疫診斷技術(shù)GB/T16550-2008中血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）方法，使用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測濃縮陽性診斷抗原效價，并與新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原進(jìn)行對比。

2結(jié)果與分析

2.1疑似病料RNA的提取及RT-PCR檢測

16份疑似病料中經(jīng)過RNA提取和RT-PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物5μL+6×loading Buffer 2μL，加樣于1%瓊脂糖凝膠中。電泳條件：電壓100V，時間20min。

檢測疑似新城疫病料共計16份（結(jié)果如圖1），檢出4份，陽性率為25%。

2.2SPF雞胚培養(yǎng)

4份陽性病料，每份第一代接種5枚，第二代接種5枚，第三代接種30枚。接種情況（如表3）：

2.3陽性病料PCR檢測

對所得4份陽性病料進(jìn)行RT-PCR檢驗，均為陽性（如圖2）。

2.4病毒效價檢測與凝集價檢測

陽性病料尿囊液通過血凝試驗（HA）分別達(dá)到2⁸、2⁷、2⁷、2⁸，符合預(yù)期。

陽性病料尿囊液所制備的4個血凝單位抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體進(jìn)行血凝抑制試驗（H1），效價結(jié)果分別為：10log2、10log2、10log2、10log2，陽性對照與PBS陰性對照無自凝，結(jié)果符合預(yù)期。

2.5陽性診斷抗原濃縮與滅活

含有50mL陽性病料尿囊液的18-25kDa透析袋放入10%蔗糖溶液經(jīng)過6h透析，每2h換液一次，濃縮為10mL。

滅活后的陽性診斷抗原經(jīng)過3代SPF雞胚傳代后，尿囊液進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖3。

4份陽性診斷抗原均為陰性，說明福爾馬林滅活陽性尿囊液達(dá)到滅活效果。

2.6濃縮陽性診斷抗原效價測定

濃縮陽性診斷抗原通過血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）檢測，結(jié)果如（表4）

濃縮陽性診斷抗原血凝試驗（HA）檢測結(jié)果分別為210、210、210和210，符合預(yù)期；血凝抑制試驗（H1）檢測結(jié)果分別為10log2、10log2、10log2和10log2，符合預(yù)期。新城疫陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)抗原血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）結(jié)果分別為2。和10log2，表明濃縮陽性診斷抗原與新城疫陽性診斷抗原具有穩(wěn)定良好的一致性。

3討論

本研究通過RT-PCR從本地疑似病料中鑒別出陽性病料，利用SPF雞胚將陽性病料純化后進(jìn)行RT-PCR檢測；將純化后的陽性尿囊液濃縮滅活制備成診斷抗原，并與雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性診斷抗原與雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性檢測抗體進(jìn)行血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）的對比，檢驗自制診斷抗原水平是否達(dá)到預(yù)期結(jié)果。在生產(chǎn)實(shí)踐中可以使用自制診斷抗原，快速對不同雞群進(jìn)行雞新城疫流行病學(xué)調(diào)查和免疫抗體的檢測，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、快速診斷、早治療的目的，減少雞場的經(jīng)濟(jì)損失。推廣后可以對我省禽傳染病的流行情況和發(fā)病情況做出更為準(zhǔn)確的判斷，為禽傳染病的防治提供基礎(chǔ)。

雞傳染性法氏囊病流行特點(diǎn)

1法氏囊病傳染性強(qiáng)、傳播速度快，雞群一旦發(fā)病，很快波及全群或全場；若沒有繼發(fā)感染，死亡率相對較低、幾乎沒有明顯的死亡高峰現(xiàn)象。

2近幾年無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生。

3法氏囊病是高度直接接觸性傳染病，且病毒有高度的耐受性，能長期存在于雞舍的環(huán)境中，不易清除。