施杏芬　邵斌　林輝　占永祥

摘要：為研究戈戈健和本草勁方對豬腸上皮細(xì)胞因子表達(dá)的影響，本實驗分別以200μg/mL的戈戈健和500μg/mL的本草勁方溶液處理豬腸上皮細(xì)胞，培養(yǎng)后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過熒光定量PCR測定各種相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，戈戈健能顯著上調(diào)IFN-β（P<0.05）、IL-6（P<0.05）、IL-8（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）和TGF-β（P<0.05）mRNA表達(dá)水平；本草勁方能顯著上調(diào)IFN-α（P<0.05）、IFN-β（P<0.01）和TGF-β（P<0.05）mRNA表達(dá)水平，顯著下調(diào)IL-6（P<0.05）和TNF-α（P<0.01）mRNA表達(dá)水平。表明這兩種中藥制劑均能通過誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒作用；戈戈健能通過促進(jìn)抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α分泌來增強(qiáng)細(xì)胞免疫，同時上調(diào)抑炎因子TGF-β表達(dá)來防止過度炎癥；本草勁方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生并促進(jìn)抑炎因子TGF-β的分泌，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗炎能力。本研究為戈戈健和本草勁方用于預(yù)防和治療豬場病毒病提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；雙黃連；IPEC-1；細(xì)胞因子；抗病毒；抗炎

近年來，傳染性疾病制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，尤其是病毒病的危害最嚴(yán)重…，如豬瘟、流感、偽狂犬病和繁殖與呼吸綜合癥等惡性病毒病給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治病毒病最常用的方法是注射疫苗，但由于病毒變異快，血清型多，導(dǎo)致疫苗的應(yīng)用效果不理想。研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥有良好的抗病毒作用，能增強(qiáng)動物的免疫力，改善機(jī)體的不良反應(yīng)，而且中藥價格低廉、毒副作用小、不會產(chǎn)生耐藥性，能廣泛應(yīng)用于病毒病的預(yù)防和治療。戈戈健的主要成分是黃芪多糖粉，黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分，大量研究表明，黃芪多糖不僅能直接殺滅病毒，還能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能而達(dá)到抗病毒的效果；可作為免疫增強(qiáng)劑，提高多種疫苗的抗體水平，增強(qiáng)疫苗免疫的效果；能提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，減少動物疾病的發(fā)生。本草勁方的主要成分是雙黃連可溶性粉，由金銀花、連翹和黃芩三味中藥研制而成，對多種致病菌和病毒有較強(qiáng)的殺滅或抑制作用，臨床用于治療細(xì)菌和病毒感染所引起的肺炎、氣管炎、支氣管炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。本研究通過體外培養(yǎng)豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-1），用戈戈健和本草勁方處理，分析各種相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的變化情況，探討這兩種中藥制劑抗病毒、抗炎癥和增強(qiáng)免疫力的作用機(jī)理，旨在為其應(yīng)用于豬場病毒病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

IPEC-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；戈戈?。S芪多糖粉）和本草勁方（雙黃連可溶性粉）由浙江博信藥業(yè)有限公司提供，用PBS配制成溶液，濃度分別為4mg/mL和10mg/mL。

1.2主要試劑

含雙抗（1001U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)液、D-Hanks液、0.25%胰酶（含0.02%EDTA）、胎牛血清均購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取試劑盒（Trizol）購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理

IPEC-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)基，于37℃5%CO，條件下培養(yǎng)，每24h換液，48h傳代。采用臺盼藍(lán)法檢測細(xì)胞活性，保持在95%以上。以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10。個/mL，按每孔0.95mL接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃5%CO，繼續(xù)培養(yǎng)6h，待細(xì)胞貼壁，進(jìn)行試驗。試驗分為空白對照組、處理組1和處理組2，每組3個重復(fù)孔。對照組加入50μLPBS；處理組1加入50μL戈戈健溶液，使其終濃度為200μg/mL；處理組2加入50μL本草勁方溶液，使其終濃度為500μg/mL，37℃5%CO₂繼續(xù)培養(yǎng)6h。

1.4樣品收集與測定

收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過熒光定量PCR測定干擾素-α（IFN-α）、干擾素-β（IFN-β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的mRNA表達(dá)量，以B-actin基因為內(nèi)參，采用Pfaffl建立的方法計算所有基因的相對表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及Duncans法多重比較。以P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果分析

2.1兩種中藥制劑對IFN表達(dá)的影響

由圖1可以看出，與對照組相比，處理組1和處理組2的IFN-α mRNA相對表達(dá)量均上升，其中處理組2的差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。由圖2可以看出，處理組1的IFN-β mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的IFN-β mRNA相對表達(dá)量較對照組極顯著上升（P<0.01）。試驗結(jié)果表明，戈戈健和本草勁方均能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。

2.2兩種中藥制劑對促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由圖3可以看出，處理組1的IL-6 mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的IL-6 mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著減少（P<0.05）。由圖4可以看出，處理組1的IL-8 mRNA相對表達(dá)量較對照組極顯著上升（P<0.01），處理組2的IL-8 mRNA相對表達(dá)量較對照組減少，但未達(dá)到顯著水平。由圖5可以看出，處理組1的TNF-α mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的TNF-α mRNA相對表達(dá)量較對照組極顯著減少（P<0.01）。試驗結(jié)果表明，戈戈健能誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生；本草勁方對促炎細(xì)胞因子有明顯的抑制作用。

2.3兩種中藥制劑對抑炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由圖6可以看出，與對照組相比，處理組1和處理組2的TGF-β mRNA相對表達(dá)量均顯著上升（P<0.05）。

試驗結(jié)果表明，戈戈健和本草勁方均能誘導(dǎo)抑炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。

3討論

干擾素是由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一類多功能活性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。按照國際標(biāo)準(zhǔn)，干擾素分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類，IFN-α、IFN-β屬于Ⅰ類干擾素，當(dāng)病毒作用于機(jī)體細(xì)胞時，Ⅰ型干擾素在數(shù)小時內(nèi)大量產(chǎn)生，作為機(jī)體防御系統(tǒng)中出現(xiàn)最早的細(xì)胞因子，在防止病毒在體內(nèi)擴(kuò)散的前期起著重要的作用。劉立民等通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能顯著提高漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞分泌的IFN-α量，促進(jìn)自身及其它細(xì)胞分泌細(xì)胞因子來抑制病毒的復(fù)制。胡克杰等研究表明精制雙黃連氣霧劑有誘導(dǎo)人外周白細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α的作用。徐凱建等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連氣霧劑和注射劑均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α。本研究表明，戈戈健能誘導(dǎo)IPEC-1的IFN-α表達(dá)水平上升，并顯著上調(diào)IFN-β mRNA表達(dá)水平；本草勁方能誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β mRNA的表達(dá)水平顯著上升，提示這兩種中藥制劑均能通過誘導(dǎo)IPEC-1產(chǎn)生Ⅰ型干擾素來抑制病毒的入侵及復(fù)制。

炎癥細(xì)胞因子可分為促炎和抑炎細(xì)胞因子兩大類，促炎細(xì)胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ等，抑炎細(xì)胞因子包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-14和TGF-β等。機(jī)體受到病原體感染后出現(xiàn)免疫應(yīng)答，釋放促炎細(xì)胞因子，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，阻止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，而抗炎細(xì)胞因子能防止過度炎癥反應(yīng)，從而避免組織器官嚴(yán)重?fù)p傷。劉立民等通過體外培養(yǎng)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，用ELISA法檢測出黃芪多糖能顯著提高IL-6和TNF-α的分泌量，促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，提高免疫球蛋白的分泌量，從而增強(qiáng)機(jī)體抗感染的能力。鄒云等通過飼養(yǎng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加黃芪多糖能顯著提高斷奶仔豬血清中的TNF含量，也能在一定程度上提高IL-6的含量。本實驗結(jié)果顯示，戈戈健能誘導(dǎo)抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著上升，具有一定的免疫增強(qiáng)作用，同時上調(diào)抑炎因子TGF-βmRNA表達(dá)以防止過度炎癥。

TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種多肽調(diào)節(jié)因子，能誘導(dǎo)IL-6、IL-8等一系列炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。賈鷹玨等用雙黃連微乳劑治療胸膜炎模型大鼠，研究發(fā)現(xiàn)，雙黃連能顯著降低大鼠胸腔滲出液中的TNF-α含量，對IL-8也有一定的抑制作用，提示雙黃連具有抗炎作用。李安泰等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液能通過降低血清和腦脊液中的炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平來治療病毒性腦炎。本研究表明，本草勁方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，同時促進(jìn)抑炎因子TGF-β的分泌，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗炎能力。

4小結(jié)

綜上所述，戈戈健具有抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用，本草勁方具有抗病毒、抗炎的作用，兩種中藥制劑均能用于預(yù)防和治療豬場病毒病，值得在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中推廣。