黃春霖 林辰壹 劉玉 李薩

摘 要：巴爾喀什黑傘是新疆獨(dú)有的珍稀野生食藥用真菌，為了解其對纖維素的降解特性，試驗以羧甲基纖維素為培養(yǎng)基內(nèi)的固定碳源，測定巴爾喀什黑傘在液體培養(yǎng)條件下菌絲體生長過程中羧甲基纖維素酶、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶活力，探討其胞外纖維素酶活力變化規(guī)律。結(jié)果顯示，巴爾喀什黑傘純菌絲體培養(yǎng)過程中，羧甲基纖維素酶活力峰值出現(xiàn)在第3 天，為0.406 U·mL-1，濾紙酶活力峰值出現(xiàn)在第2天，為0.238 U·mL-1，二者變化規(guī)律均表現(xiàn)出峰值后波動降低的趨勢;β-葡萄糖苷酶活力變化近“S”型，峰值出現(xiàn)在第12天，為1.233 U·mL-1，該酶活力峰值出現(xiàn)時間較濾紙酶和羧甲基纖維素酶明顯滯后。

關(guān)鍵詞：巴爾喀什黑傘;碳源;羧甲基纖維素;纖維素酶

中圖分類號：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.015

Study on the Change Regularity of Extracellular Enzyme Activity of Agaricus balchaschensis

HUANG Chunlin1， LIN Chenyi1， LIU Yu2， LI Sa1

（1. College of Forestry and Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830052， China; 2. Agricultural Technology Promotion Center in Midong District in Urumqi， Urumqi， Xinjiang 831400， China ）

Abstract： The Agaricusbalchaschensis is a unique and rare wild edible medicinal fungus in Xinjiang. In order to understand its degradation to cellulose， carboxymethyl cellulose（CMC） was used as a fixed carbon source in the culture medium to determine the activities of carboxymethyl cellulase， filter paper enzymes（FP） and β-glucosidase（BG） of A. balchaschensis. The results showed that during the cultivation of the pure mycelium of A. balchaschensis， the peak of CMC activity appeared on the third day， which was 0.406 U·mL-1， and the peak of enzyme activity of FP appeared on the second day， which was 0.238 U·mL-1， both of the two enzymatic activity above showed a tendency to decrease after the peak. The BG activity had a tendency nearly "S" type， and the peak appeared on the 12th day， which was 1.233 U·mL-1， the peak appearance time was significantly delayed compared to FP and CMC activity.

Key words： Agaricus balchaschensis;carbon source;carboxymethyl cellulose;cellulase

新疆地大物博，享有得天獨(dú)厚的自然環(huán)境優(yōu)勢，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)的調(diào)整升級，加之新疆獨(dú)有的野生食用菌資源豐富，對于新疆農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展以及食用菌的生產(chǎn)存在著諸多的發(fā)展?jié)摿蜋C(jī)遇。巴爾喀什黑傘（Agaricus balchaschensis Samgina & G.A.Nam）隸屬于蘑菇科蘑菇屬[1]，是國內(nèi)獨(dú)有的且僅分布于新疆博斯騰湖和巴里坤湖等內(nèi)陸湖泊沿岸，極具營養(yǎng)價值的珍稀野生食用菌[2]。巴爾喀什黑傘菌柄與菌蓋中富含鈣、鎂、鐵等礦質(zhì)元素，含量均顯著高于雙孢蘑菇、香菇、金針菇及平菇，并且子實體中還包含12種脂肪酸，其中，亞油酸和棕櫚酸含量所占比例較大[3]，是集食藥用價值于一身的天然保健食品。

與食用菌生長密切相關(guān)的胞外酶共有6種，研究比較成熟的有纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶[4]。研究認(rèn)為，大多數(shù)食用菌在生長過程中對培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的利用與胞外酶活力變化規(guī)律是相關(guān)的，例如雙孢蘑菇在菌絲體生長時期，胞外淀粉酶活力與木質(zhì)素的降解速率呈現(xiàn)正相關(guān)性，在子實體生長時期羧甲基纖維素酶（endo-1，4-β-D-glucanase， 簡稱CMC酶）和濾紙酶（Filter paper cellulose， 簡稱FP酶）與纖維素降解的速率呈現(xiàn)正相關(guān)性，子實體生物量與羧甲基纖維素酶活力高低存在正相關(guān)性[5-6]。同樣，在姬松茸的相關(guān)研究指出，姬松茸胞外CMC酶、FP酶呈周期性變化，活力高峰對應(yīng)子實體成熟期[7]。纖維素酶屬于水解纖維系，其主要成分內(nèi)切葡聚糖酶（CMC酶）、外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase， 簡稱CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4- glucosidase， 簡稱BG酶）協(xié)同作用，經(jīng)過3個水解步驟將纖維素轉(zhuǎn)化葡萄糖，并且這3個水解過程同時發(fā)生[8]。

本試驗通過研究巴爾喀什黑傘在純菌絲體培養(yǎng)條件下其胞外纖維素酶活力變化規(guī)律，進(jìn)一步分析纖維素大分子營養(yǎng)物質(zhì)的降解利用特性，旨在為提高巴爾喀什黑傘生物學(xué)效率以及充分挖掘其內(nèi)在利用潛力提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌種采用新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗室經(jīng)組織分離低溫保藏的巴爾喀什黑傘菌株，編號為XJAU-Ab2016。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵液制備 采用曹春蕾等[9]的方法進(jìn)行。將PDA加富培養(yǎng)基（馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂加富培養(yǎng)基）中葡萄糖替換為等量的羧甲基纖維素20 g，并去除培養(yǎng)基中的瓊脂制成液體培養(yǎng)基[10]。將制備好的液體培養(yǎng)基分裝至250 mL三角瓶，每瓶注入培養(yǎng)液150 mL，其中各處理設(shè)置3次重復(fù)。每150 mL液體培養(yǎng)基接種直徑為5 mm菌絲圓片3片。靜置12 h后于25 ℃恒溫，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)周期14 d。

1.2.2 待測酶液的制備 從振蕩培養(yǎng)開始每天同一時間均勻取發(fā)酵培養(yǎng)液10 mL，采用快速定量濾紙過濾后，將混合培養(yǎng)液分裝至5 mL離心管，4 000 r·min-1離心10 min，獲得上清液即為待測的粗酶液[11]。

（1）CMC酶活力的測定。 參照邊銀丙[12]的方法進(jìn)行。向25 mL的具塞刻度試管內(nèi)加入0.52%的羧甲基纖維素溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配制）1.5 mL，在50 ℃水浴條件下預(yù)熱3 min后，加入待測酶液0.5 mL混勻，50 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS（3，5二硝基水楊酸）試劑 3.0 mL，以煮沸滅活的酶液作對照，每個處理3次重復(fù)。搖勻后迅速置入沸水中，加熱10 min，流水冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25 mL，充分混勻測540 nm處吸光值。將不同濃度的葡萄糖溶液設(shè)置6個梯度，其中每毫升標(biāo)準(zhǔn)液中所含葡萄糖量為1 mg，分別取標(biāo)準(zhǔn)液0.1～0.6 mL用蒸餾水逐一補(bǔ)足至2 mL與DNS試劑反應(yīng)共熱，測540 nm處的吸光值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）BG酶活力的測定。 依據(jù)孫驪珠等[13]的方法并稍作調(diào)整。向25 mL具塞刻度試管中加入0.5%的水楊苷（購自Sigma公司）溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配制）1.5 mL，后續(xù)操作程序同CMC酶活力測定方法。

（3）FP酶活力的測定。 參照邊銀丙[12]的方法進(jìn)行。取干燥平衡24 h后的定性濾紙，剪裁成寬度1 cm，質(zhì)量為（50±0.5） mg的濾紙條，將濾紙條折疊成“M”狀，置入25 mL具塞刻度試管底部;之后緩慢加入0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH值4.8）1.5 mL，使濾紙完全浸沒于緩沖液中;在50 ℃水浴條件下預(yù)熱3 min后，分別加入待測酶液0.5 mL，置于50 ℃水浴中保溫60 min，其余步驟同CMC酶測定。

每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物或轉(zhuǎn)化1 μmol相關(guān)基團(tuán)所需的酶量為1個酶活力單位（U·mL-1）。

酶活力=■ ×1 000×V （1）

式中，m是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出OD值對應(yīng)的葡萄糖含量（μg）;M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量（g·mol-1）;0.5為反應(yīng)時所需的酶液體積（mL）;t為水浴反應(yīng)的時間（min）;1 000為轉(zhuǎn)化子（1 mmol=1 000 μmol）;V表示所取粗酶液總體積（mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010整理，使用SPSS 21.0通過One-way ANOVA及Duncan法對纖維素酶活力在不同培養(yǎng)時間內(nèi)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴爾喀什黑傘CMC酶活力變化規(guī)律

巴爾喀什黑傘在14 d的培養(yǎng)周期內(nèi)均可檢測出CMC酶活力（圖1），CMC酶活力隨培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)出先降低后增加至峰值，然后逐漸降低并保持相對穩(wěn)定，其峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)周期內(nèi)的第3 天，為0.406 U·mL-1，顯著高于其他培養(yǎng)時間（P <0.05），較14 d培養(yǎng)周期內(nèi)CMC活力均值0.265 U·mL-1高出53.2%，是活力最小值（第14天）的1.8倍;繼峰值出現(xiàn)后的第4～14天，CMC酶活力均顯著低于1～3 d（P <0.05），整體呈波動下降趨勢。

2.2 巴爾喀什黑傘BG酶活力變化規(guī)律

由圖2可知，隨培養(yǎng)時間延長，巴爾喀什黑傘BG酶活力先升高至峰值后略有下降，整體變化規(guī)律近“S”型，其峰值出現(xiàn)在第12天，為1.233 U·mL-1，較培養(yǎng)周期內(nèi)該酶活力均值0.823 7 U·mL-1高出49.69%，是最小值（第2 天）的5.0倍。BG酶活力在培養(yǎng)周期的第1～3天差異不顯著，在第4～9 天顯著增加（P<0.05），第10天顯著下降（P<0.05）至第8 d的活力水平。第11天和第12天差異不顯著（P>0.05），活力均顯著高于其他各培養(yǎng)時間（P<0.05）。第13天和第14天顯著下降（P<0.05）至第9天的活力水平。

2.3 巴爾喀什黑傘FP酶活力變化規(guī)律

由圖3可知，隨培養(yǎng)時間延長，巴爾喀什黑傘FP酶活力呈現(xiàn)先增大后波動降低的趨勢，后期保持相對平穩(wěn)的水平。FP酶活力峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)周期內(nèi)的第2天，為0.238 U·mL-1，顯著高于其他培養(yǎng)時間（P <0.05），較培養(yǎng)周期內(nèi)FP酶活力均值0.231 U·mL-1高出3.0%，是最小值（第8、14天）的1.7倍。培養(yǎng)周期的第3天和第6天 FP酶活力值顯著低于第2天（P<0.05），顯著高于第1天、第4天、第8天、第10～14天（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

巴爾喀什黑傘在以羧甲基纖維素為碳源的條件下，均可檢測出CMC酶、BG酶和FP酶的活力。在巴爾喀什黑傘菌絲體生長期間，CMC酶活力峰值出現(xiàn)后開始下降并趨于穩(wěn)定。在雙孢蘑菇中，菌絲體生長時期CMC酶活力在其整個生長發(fā)育階段處于最低水平，但隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，菌絲體CMC酶活力緩慢增加[14]，這與本研究的結(jié)果有所差異，說明巴爾喀什黑傘對纖維素代謝能力有其自身的特性。由于纖維素酶屬于誘導(dǎo)酶系[15]，不同底物所構(gòu)成的培養(yǎng)基對CMC酶活力具有誘導(dǎo)作用[16]，因此，要提高巴爾喀什黑傘纖維素代謝水平以及產(chǎn)纖維素酶的能力，可能需在培養(yǎng)基質(zhì)中添加相應(yīng)的誘導(dǎo)物質(zhì)。BG酶在菌絲體生長期間表現(xiàn)出遞增的趨勢，隨培養(yǎng)時間的延長持續(xù)增大并趨于穩(wěn)定，變化規(guī)律呈近“S”型。BG酶活力峰值出現(xiàn)的時間為第12天，相對于FP酶及CMC酶活力峰值具有明顯的滯后性，這也驗證了CMC酶在降解纖維素的同時，多種胞外纖維素酶協(xié)同作用，最終由BG酶水解纖維二糖轉(zhuǎn)換為單糖，逐步積累供菌絲體利用的作用機(jī)理[17]。

FP酶在培養(yǎng)周期內(nèi)同樣表現(xiàn)出達(dá)到峰值后活力下降，整體保持相對平穩(wěn)的變化趨勢，這與梁志英等[18]對姬松茸的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)菌絲體生長時期FP酶活力變化保持相對平穩(wěn)的趨勢結(jié)論一致，該研究還指出姬松茸對纖維素的降解能力低于木質(zhì)素，而本文對于巴爾喀什黑傘利用木質(zhì)素的能力是否優(yōu)于纖維素還有待進(jìn)一步的探究。由于濾紙可以表現(xiàn)出與纖維素聚合度及結(jié)晶度一致的條件，故可用FP酶表征纖維素酶的總糖化能力[19]，通過巴爾喀什黑傘FP酶活力變化規(guī)律可知，其總糖化能力在培養(yǎng)周期內(nèi)保持相對穩(wěn)定的水平。

胞外纖維素酶的分泌對巴爾喀什黑傘營養(yǎng)利用具有重要的影響，同時對菌絲體生長也存在著制約或促進(jìn)的作用。因此，對巴爾喀什黑傘胞外纖維素酶活力的探討能夠進(jìn)一步了解其對多糖類碳源利用的特性，可為巴爾喀什黑傘資源的開發(fā)以及生理生化研究奠定基礎(chǔ)。

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