劉元元 李曉哲 董海新

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272000)

艱難梭菌，是定植在人類腸道的正常菌群，一旦菌群失調(diào)，成為條件致病菌后，輕可引起腹瀉，重則導(dǎo)致爆發(fā)性偽膜性腸炎，甚至死亡。近十幾年來(lái)，隨著抗生素的不合理使用，世界范圍內(nèi)艱難梭菌感染日趨嚴(yán)重，已成為美國(guó)院內(nèi)感染最主要的致病菌[1]，歐洲也發(fā)生了多次暴發(fā)事件[2]。分析認(rèn)為可能與高毒力菌株核糖體分型027型播散有關(guān)。我國(guó)大陸地區(qū)90年代后陸續(xù)開(kāi)始艱難梭菌感染監(jiān)測(cè)，2015年已有027型的報(bào)道[3]。由于國(guó)內(nèi)研究起步晚，目前僅有局部的研究報(bào)道，尚無(wú)全國(guó)性的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。筆者調(diào)查了濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院艱難梭菌感染狀況。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選自2014年1月至12月住院病人腹瀉患者106例(前期組)及2016年1月至12月腹瀉患者90例(后期組)，大便通常為稀便、水樣便或半成形便，腹瀉≥3次/24h，持續(xù)超過(guò)2d。

1.2 試劑與儀器

艱難梭菌顯色培養(yǎng)基、厭氧罐、艱難梭菌毒素檢測(cè)試劑盒、VIDAS熒光免疫分析儀(梅里埃公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN) ，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)。

1.3 方法

1.3.1艱難梭菌培養(yǎng) 將糞便標(biāo)本與等比例無(wú)水乙醇混合，室溫靜置1h，漩渦震蕩混勻后離心，取沉淀接種于艱難梭菌鑒別培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h。取可疑菌落進(jìn)行耐氧試驗(yàn)，染色鏡檢，觀察是否為革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌。鏡檢符合者傳代培養(yǎng)，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.2艱難梭菌毒素A/B檢測(cè) 按照操作說(shuō)明書(shū)，取適量糞便標(biāo)本加于樣本稀釋液中震蕩混勻，離心取上清，加入毒素檢測(cè)試劑條加樣孔中，放入VIDAS儀器中檢測(cè)。

1.3.3艱難梭菌PCR毒素檢測(cè) 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按操作說(shuō)明，提取艱難梭菌基因組DNA，進(jìn)行tcdA、tcdB基因擴(kuò)增。引物參照前期設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系為25μl，包括上下游引物1μl、模板DNA 2μl、Taq Master Mix 12.5μl、去離子水8.5μl，擴(kuò)增程序：95℃ 1min，95℃ 15s、62℃ 2min、72℃ 40s(tcdA),95℃ 20s、55℃ 30s、60℃ 2min (tcdB)30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min。擴(kuò)增完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳30min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同方法艱難梭菌檢測(cè)情況

為驗(yàn)證兩種不同檢測(cè)方法檢測(cè)艱難梭菌的情況，將前期組106 例及后期90例非重復(fù)標(biāo)本合并，綜合比較，厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性率15.82%(31/196)與酶免疫分析檢測(cè)陽(yáng)性率12.24%(24/196)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩種方法診斷結(jié)果一致性一般(Kappa=0.684，P<0.001)，見(jiàn)表1。厭氧培養(yǎng)所得艱難梭菌經(jīng)PCR擴(kuò)增，前期組培養(yǎng)陽(yáng)性菌株16例均可檢測(cè)出毒素A、B,后期組13株毒素陽(yáng)性，2株毒素陰性，產(chǎn)毒株陽(yáng)性率為14.4%。見(jiàn)圖1。

圖1 毒素?cái)U(kuò)增結(jié)果

注：經(jīng)McNemar檢驗(yàn)，P=0.118。

2.2 不同時(shí)期艱難梭菌檢測(cè)情況

無(wú)論采用哪種方法，前期后期艱難梭菌感染率都在10%以上。經(jīng)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)期同一方法艱難梭菌檢出情況比較

2.3 艱難梭菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者臨床分布情況

前期組均為成人標(biāo)本，主要分布科室為外科，在性別分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。后期組未限制年齡，兒科、血液、腎內(nèi)所占比例較高，在年齡及性別分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。住院期間陽(yáng)性患者多單一或聯(lián)合使用過(guò)一代、三代頭孢類、喹諾酮類等抗生素。

表3 培養(yǎng)陽(yáng)性患者分布情況

3 討論

目前艱難梭菌檢測(cè)方法有多種，不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。一般公認(rèn)的最好方法為組織細(xì)胞毒素檢測(cè)，該方法敏感性、特異性可達(dá)98%以上，主要缺點(diǎn)是技術(shù)要求高，檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)，而且操作繁瑣，無(wú)法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作。厭氧培養(yǎng)耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，需要專門(mén)的厭氧設(shè)備，接種要求苛刻，但對(duì)于菌株的基因分型以及檢測(cè)藥物敏感性等仍具有重要的應(yīng)用價(jià)值；酶免疫學(xué)方法操作簡(jiǎn)便快速，實(shí)用性好，靈敏度、特異度相對(duì)較低，適合臨床快速篩查和早期診斷；核酸擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)要求高，儀器昂貴，但較敏感、特異。本文選用顯色培養(yǎng)、酶免法、PCR方法，陽(yáng)性率無(wú)顯著差異。前期厭氧培養(yǎng)曾選用成品艱難梭菌鑒別平板，但陽(yáng)性率較低。改用顯色平板后，陽(yáng)性率明顯提高，同其他報(bào)道結(jié)果一致。

本文顯示，艱難梭菌感染患者中男女陽(yáng)性率雖有一定差異，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而國(guó)內(nèi)薈萃分析表明[4]，男性比女性感染率要高。分析原因可能是不同地區(qū)、不同醫(yī)院感染狀況本身存在不同或者標(biāo)本量不充足所致的偏倚，為排除該偏倚，下一步應(yīng)繼續(xù)增大標(biāo)本量。一直以來(lái)普遍認(rèn)為高齡是艱難梭菌感染的危險(xiǎn)因素之一，>65歲成人是感染的主要人群[5-7]。有研究者對(duì)不同年齡人群感染狀況分析發(fā)現(xiàn)，1歲以內(nèi)隨月份增加兒童艱難梭菌感染率有上升趨勢(shì)，所以兒童艱難梭菌感染也不容忽視。故后期收集的標(biāo)本包含來(lái)源于兒童的部分。從后期陽(yáng)性標(biāo)本看，兒童和成人感染率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明我院艱難梭菌感染涵蓋年齡跨度大，需普遍關(guān)注。

兩個(gè)時(shí)期進(jìn)行顯色培養(yǎng)及酶免疫學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率基本一致,說(shuō)明從2014年至2017年院內(nèi)持續(xù)有艱難梭菌感染發(fā)生，且感染率前后并無(wú)大的差別，與國(guó)內(nèi)艱難梭菌感染率水平相符[8]。在醫(yī)院科室構(gòu)成上，外科、兒科、血液、腎內(nèi)等陽(yáng)性率相對(duì)偏高，其他科室也有散在分布，表明我院艱難梭菌感染范圍廣泛，但又有集中某些科室分布的趨勢(shì)?？赡芘c這些科室抗生素使用過(guò)多、住院時(shí)間長(zhǎng)，環(huán)境定植污染等因素有關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái)，醫(yī)院一直在規(guī)范抗生素的合理使用，嚴(yán)格遵循抗生素使用分級(jí)管理制度，減少抗生素濫用，而且盡量縮短患者住院時(shí)間，加強(qiáng)工作人員手衛(wèi)生及患者周圍環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)特殊感染患者進(jìn)行隔離治療。盡管如此，我院艱難梭菌感染形勢(shì)依然不容樂(lè)觀，院感部門(mén)應(yīng)加大監(jiān)控力度，尤其是對(duì)感染率高的科室應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，及時(shí)制定有效預(yù)防控制措施，減少定植與傳播。