宗秋芳，黃焱杰，吳麗思，吳圣龍，2，包文斌，2，*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

生命體遺傳信息由具有不同功能的蛋白所傳遞，蛋白質(zhì)是由20種氨基酸組成的多聚體，而密碼子又決定了氨基酸的種類[1]。每種氨基酸中通用遺傳密碼包含1～6個密碼子，這些密碼子稱為同義密碼子。同義密碼子的個別優(yōu)先使用稱為密碼子偏好性[2]，密碼子使用偏好性是指在翻譯過程中某個密碼子的使用頻率高于其他同義密碼子的情況，這通常是適應(yīng)性演變的結(jié)果[3]。密碼子使用偏好性對基因組有著重要影響[4]，不同的基因在同一個基因組中表現(xiàn)出不同的密碼子偏好性，即使在相同的基因組中，密碼子使用模式也不一定相同[5]。密碼子偏好性分析可用于進(jìn)一步理解物種的遺傳和進(jìn)化路徑，同時，深入理解密碼子偏好性在準(zhǔn)確預(yù)測相關(guān)基因功能方面也發(fā)揮著重要作用。通過對密碼子偏好性分析可以發(fā)現(xiàn)基因偏好使用的最優(yōu)密碼子，然后對其余密碼子進(jìn)行改造和優(yōu)化，進(jìn)而提高外源基因在宿主內(nèi)的表達(dá)水平[1]。因此，密碼子使用偏好性分析在尋求改善宿主細(xì)胞內(nèi)的外源基因表達(dá)水平方面具有重要意義[6]。

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起仔豬腹瀉的主要病原體之一，具有高度傳染性[7]，可通過感染豬腸道上皮細(xì)胞誘發(fā)黏膜破壞，造成腸絨毛萎縮甚至導(dǎo)致仔豬死亡[8-9]。Claudin家族作為重要的緊密連接蛋白之一，是組成腸道黏膜屏障完整性、決定腸道通透性的重要蛋白分子[10]。研究表明，Claudins具有多種功能，其可通過調(diào)控細(xì)胞旁電荷的選擇性來調(diào)節(jié)組織滲透性，參與維持上皮細(xì)胞極性和腸道上皮細(xì)胞的屏障功能[11-12]。此外，Jia等[13]發(fā)現(xiàn)Claudin家族編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)量在正常和腫瘤組織中存在差異，利用其表達(dá)的高度特異性，可將其作為多種腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Patel等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利用營養(yǎng)手段提高Claudins基因及蛋白的表達(dá)，可調(diào)節(jié)腸上皮通透性，增強(qiáng)腸道屏障功能。由此表明，Claudins基因的表達(dá)水平在腸道屏障功能的維持中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。前人的研究多集中于從緊密連接蛋白的表達(dá)調(diào)控和營養(yǎng)水平來研究該基因的功能，但從密碼子角度研究豬Claudins基因表達(dá)水平的報道較少。目前，緊密連接蛋白Claudin家族基因的密碼子使用偏好性在很大程度上仍然是未知的。因此，本文對Claudin家族22個基因編碼序列進(jìn)行分析，利用CodonW和EMBOSS Explore計算核苷酸組成、相對同義密碼子使用度和密碼子使用偏性參數(shù)，同時分析了Claudin家族基因密碼子使用偏好性的影響因素，旨在揭示這些基因之間的遺傳和進(jìn)化關(guān)系，了解轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制，在預(yù)測外源基因的最適宿主和通過密碼子優(yōu)化途徑改良外源基因以提高其表達(dá)水平等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)的獲取

Claudin家族22個基因的全長編碼區(qū)序列(coding DNA sequence，CDS)來源于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，用于后續(xù)的密碼子偏好性分析，詳細(xì)信息見表1。

1.2 堿基組成偏好性分析

利用CodonW 1.4.2軟件包和在線網(wǎng)站EMBOSS Explore分析比較Claudin家族22個基因序列的密碼子使用特性參數(shù)，并統(tǒng)計以下指標(biāo)：(1)各堿基在密碼子第3位上的含量(A3s、C3s、G3s、T3s)；(2)密碼子第1、2、3位堿基G+C含量(GC1s、GC2s、GC3s)；(3)密碼子整體GC含量(GC)。其中GC1s、GC2s來源于在線網(wǎng)站EMBOSS(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)軟件包中的CUSP，其余來自CodonW。

表1 Claudin基因家族成員信息

1.3 密碼子使用偏好性相關(guān)參數(shù)分析

運(yùn)用CodonW 1.4.2軟件包以及CHIPS、CUSP在線程序計算以下參數(shù)。

1.3.1 有效密碼子

有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENC)是評價基因密碼子偏好性分析中最有參考意義的指標(biāo)之一。它是指一個基因的密碼子使用頻率與其同義密碼子平均使用頻率偏差的量化值[15]，其值在20到61之間，值越小表明密碼子偏好性越強(qiáng)，基因的表達(dá)水平越高，可以反映出同義密碼子非均衡使用的偏好程度[16-17]。ENC值大于55表明該基因低表達(dá)，小于30則該基因高表達(dá)[18]。

1.3.2 最優(yōu)密碼子頻率

最優(yōu)密碼子頻率(frequency of optimal codon，F(xiàn)OP)是指某個物種中表達(dá)量最高且使用頻率最高的密碼子，代表最優(yōu)密碼子占所有同義密碼子數(shù)的比例[19]，是衡量密碼子使用偏好性的一個常用指標(biāo)。其值在0.36至1之間[20-21]，值為0.36表示密碼子偏性最弱，值為1則表示密碼子偏性最強(qiáng)[22]。

1.3.3 密碼子偏好指數(shù)

密碼子偏好指數(shù)(codon bias index，CBI)反映了一個具體基因中高表達(dá)優(yōu)越密碼子的組分情況。對宿主自身的基因而言，該指數(shù)和ENC值有很好的相關(guān)性，可以很好地反映外源基因在宿主中的表達(dá)情況[23]。若該值為1，表示所有密碼子均偏向使用；若值為0則表示所有密碼子完全隨機(jī)使用[20]。

1.3.4 密碼子適應(yīng)指數(shù)

密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)是反映氨基酸編碼時所有同義密碼子與某一特定密碼子最佳使用相符合的程度，可估算高表達(dá)基因中密碼子的偏好程度，評估密碼子使用模式的有效選擇，其值在0～1之間[20-21]。值為0表示所有密碼子被平均使用，值為1則表示僅有一個最優(yōu)密碼子被使用，且該密碼子偏性最強(qiáng)，表達(dá)水平也最高[24]。

1.4 相對同義密碼子使用度分析

相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)指的是某個密碼子與其無偏好使用時頻率間的比值，可以衡量密碼子的偏好程度。若RSCU值為1，表明此時密碼子無偏好性，若RSCU值大于1，說明該密碼子存在偏好性，使用頻率較高，大于1.6表示該密碼子偏好性較強(qiáng)，小于1則相反[25]。

1.5 統(tǒng)計分析

以Claudin家族的22個基因?yàn)檠芯繉ο螅?4個密碼子中除去3個終止密碼子(TAA、TAG、TGA)和2個只編碼色氨酸(Trp)和蛋氨酸(Met)的密碼子后，把其他59個密碼子的RSCU值導(dǎo)入，利用HemI 1.0軟件繪制出聚類熱圖(Heat map)。利用MEGA 7.0進(jìn)行CDS序列的聚類分析，構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹(neighbor joining，NJ)。

1.6 影響密碼子使用偏好性的因素分析

1.6.1 ENC繪圖

ENC繪圖(ENC-plot)可以有效地探索基因密碼子使用的異質(zhì)性[16]。它是以GC3s為橫坐標(biāo)，ENC值為縱坐標(biāo)，分析基因堿基組成對密碼子偏好性影響的一個指標(biāo)，用于分析影響密碼子使用的主要因素[16]。若基因沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布或落在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，說明密碼子偏好性僅受突變壓力影響，若基因落在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置，說明密碼子偏好性僅受選擇作用影響[26]。

1.6.2 PR2繪圖

在A3s、C3s、G3s、T3s值基礎(chǔ)上，計算A3/(A3+T3)、G3/(G3+C3)。PR2(parity rule 2)是以G3/(G3+C3)為橫坐標(biāo)，A3/(A3+T3)為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖[27]，從中心[坐標(biāo)(0.5，0.5)]出發(fā)的矢量表示PR2偏倚的方向和程度[28]。

1.6.3 中性繪圖

中性繪圖(neutrality plot)可以反映自然選擇壓力和突變壓力對密碼子使用模式的影響程度[29]。分別統(tǒng)計密碼子第1位GC含量GC1、密碼子第2位GC含量GC2、密碼子第3位GC含量GC3，其中GC1與GC2的平均值用GC12表示。中性繪圖即GC12與GC3s之間的相關(guān)性分析，以GC3s為橫坐標(biāo)，GC12為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖[30]。若GC12與GC3s之間存在顯著相關(guān)性，表明密碼子3個堿基組成無差異，密碼子偏好性受突變壓力影響較強(qiáng)；若GC12與GC3s之間相關(guān)性不顯著，則密碼子3個堿基組成不同，密碼子偏好性更多受到自然選擇壓力影響[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Claudin家族22個基因的密碼子堿基組成

Claudin家族22個基因同義密碼子第3位4種堿基的含量由CodonW 1.4.2軟件包分析所得，結(jié)果如表2所示。整體堿基組成分析顯示，大多數(shù)基因密碼子G+C堿基含量高于A+T堿基含量(Claudin-16除外)，GC3s為44.8%～96.1%，平均值是74.6%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.138。除了Claudin-16基因，其余21個基因的GC和GC3含量均高于0.5，說明Claudin家族基因主要偏好以G/C結(jié)尾的密碼子，Claudin-3、Claudin-4、Claudin-9、Claudin-14基因的GC3含量大于0.9，說明這4個基因?qū)/C結(jié)尾的密碼子偏好性極強(qiáng)。

2.2 Claudin家族密碼子使用偏性相關(guān)參數(shù)分析

為了進(jìn)一步分析Claudin家族各基因密碼子偏好程度，利用CHIPS、CUSP在線程序分析比較了22個基因密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)指標(biāo)(表3)。Claudin家族22個基因的ENC值為29.65～56.56，Claudin-1和Claudin-16基因低表達(dá)，Claudin-4和Claudin-14基因高表達(dá)，其他18個基因表達(dá)水平一般。FOP值介于0.444～0.649，表明Claudin家族22個基因密碼子使用存在一定的偏好性。CBI指數(shù)用于評估外源基因在目的宿主中可能的表達(dá)情況，本研究中21個基因CBI值均大于0，其中Claudin-3的CBI值最大，為0.406，表明密碼子偏性較強(qiáng)，Claudin-25偏性為0.073，接近于0，表明該基因密碼子幾乎完全隨機(jī)使用。Claudin-16基因的CBI值為負(fù)數(shù)，可能是該基因最佳密碼子數(shù)少于期望值。22個基因的CAI值介于0.200～0.373，分布比較集中，說明密碼子選擇無較大偏好性。綜合分析，Claudin家族不同基因?qū)γ艽a子的使用不存在絕對的偏好性。

表2 Claudin家族密碼子堿基組成

2.3 Claudin家族基因的相對同義密碼子使用度

本研究運(yùn)用CodonW 1.4.2軟件包計算Claudin家族22個基因59個密碼子相對密碼子使用度(表4)，衡量這些基因同義密碼子使用偏移情況。23個密碼子RSCU值大于1，為高頻密碼子，并且全部以G/C結(jié)尾。其中CUG、AUC、GUG、UCC、CCC、ACC、GCC、CAG、CGC、CGG、GGC這11個密碼子RSCU值大于1.6，偏好性較強(qiáng)。CUG使用頻率最高，RSCU值為3.35，密碼子偏好性最強(qiáng)；UUA使用頻率最低，RSCU值為0.12，密碼子偏好性最弱。

表3 22個基因密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)

表4 Claudin家族基因相對同義密碼子使用度RSCU整體值

Claudin家族基因相對密碼子使用度頻率用RSCU值表示，上標(biāo)“*”表示RSCU值大于1.6。

The relative frequency of codon usage of theClaudinfamily gene were expressed by the RSCU value，and the superscript “*” indicated that the RSCU value was greater than 1.6.

2.4 密碼子使用模式的系統(tǒng)關(guān)系

利用HemI 1.0和MEGA 7.0對Claudin家族22個基因基于密碼子RSCU值和CDS序列分別進(jìn)行了聚類。RSCU聚類結(jié)果(圖1)顯示，Claudin-1和Claudin-20、Claudin-25聚為一類，最后與Claudin-16聚為一類。CDS序列聚類結(jié)果(圖2)顯示Claudin-3和Claudin-4較為接近，Claudin-10和Claudin-11較為接近。2種分析的聚類結(jié)果不一致，基于CDS的系統(tǒng)進(jìn)化樹更接近這22個基因的真實(shí)系統(tǒng)分類。

2.5 密碼子使用影響因素分析

每個長方形代表一個密碼子的RSCU值，顏色強(qiáng)度代表了不同RSCU值：強(qiáng)度在白色(RSCU<1.6)和黑色(RSCU>1.6)之間。Each rectangle represented the RSCU value of one codon，and the color intensity represented different RSCU values: the intensity was between white (RSCU<1.6) and black (RSCU>1.6).圖1 Claudin家族22個基因密碼子相對使用度RSCU聚類Fig.1 Clustering of RSCU values of each codon among 22 genes of Claudin family

圖2 Claudin家族22個基因密碼子CDS序列聚類Fig.2 Clustering analysis of CDS sequence of 22 genes of Claudin family

2.5.1 ENC繪圖分析

本研究中GC3s為0.44～0.96，ENC值為30～57，ENC值與GC3s呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.906，P<0.01)(圖3)。Claudin家族22個基因的ENC值都沿著標(biāo)準(zhǔn)曲線下方附近均勻分布，表明22個基因密碼子偏好性主要受到突變壓力影響。

各點(diǎn)代表Claudin家族各基因；實(shí)線表示隨機(jī)密碼子使用假設(shè)下GG3s含量與ENC值之間的關(guān)系。Each point represented the genes of the Claudin family; The solid line indicated the relationship between the GG3s content and the ENC value under random codon usage assumptions.圖3 ENC值與GC3s關(guān)聯(lián)性分析Fig.3 Correlation analysis of ENC and GC3

2.5.2 PR2-plot

為進(jìn)一步分析22個基因在密碼子堿基組成上的偏好性，利用PR2-plot比較ATCG在密碼子中的關(guān)系。以(0.5，0.5)為中心畫十字，從圖4可以看出，大多數(shù)點(diǎn)都位于十字左側(cè)，上下均有分布，發(fā)現(xiàn)22個基因密碼子第3位堿基含量A比T高，C比G高，說明在密碼子使用中堿基存在不均衡使用現(xiàn)象。

圖4 A3/(A3+T3)值與G3/(G3+C3)關(guān)聯(lián)性分析Fig.4 Correlation analysis of A3/(A3+T3) and G3/(G3+C3)

2.5.3 中性繪圖

22個基因密碼子的GC12與GC3s值中性分析結(jié)果見圖5，由圖可以看出，GC12和GC3s之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系(r=0.755，P<0.01)，表明密碼子3個堿基組成無明顯差異，密碼子偏好性主要受突變壓力影響。

圖5 GC12與GC3s關(guān)聯(lián)性分析Fig.5 Correlation analysis of GC12 and GC3

3 討論

密碼子偏好性分析對于深入了解轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的調(diào)控機(jī)制、預(yù)測外源基因最佳宿主，以及通過改良外源基因進(jìn)而提高其表達(dá)水平具有重要意義[32]。密碼子使用模式在生物體之間和同一基因組的基因之間存在很大差異[33-35]。Grantham等[36-37]提出每個基因組都有一個特定的密碼子使用特征，它反映了特定基因組內(nèi)的進(jìn)化力。緊密連接蛋白基因Claudin在腸道屏障的損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[38]，其表達(dá)量提高有助于維護(hù)腸道黏膜屏障完整性，進(jìn)而緩解仔豬腹瀉，因此，提高Claudin基因的表達(dá)量對于維護(hù)腸道黏膜屏障完整性以及預(yù)防仔豬腹瀉具有重要意義。

對密碼子使用模式的分析可以為同義密碼子偏好使用的相關(guān)機(jī)制提供基礎(chǔ)[39]。同義密碼子的差異性主要由GC3s決定，由于密碼子第3位堿基受到的突變壓力較小，因此GC3s在分析密碼子使用模式中作為一個重要參數(shù)被廣泛使用[40]。本研究統(tǒng)計了Claudin家族22個基因同義密碼子末位堿基含量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因密碼子G+C堿基含量高于A+T堿基含量，且GC和GC3含量均高于0.5。進(jìn)一步對相對密碼子使用度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RSCU值大于1的密碼子全部以G/C結(jié)尾，RSCU值大于1表示該密碼子使用頻率較高，說明Claudin家族基因主要偏好使用以G/C結(jié)尾的密碼子。該基因家族密碼子使用模式特征與歐洲葡萄bHLH基因家族使用特征一致[41]，結(jié)合影響密碼子偏好性的因素進(jìn)行分析，可能是基因在家族進(jìn)化過程中受到GC到AT的突變壓力比AT到GC的突變壓力高。已有研究證明，基因密碼子偏好性可能受其組成偏好性以外其他因素的影響，如突變壓力和自然選擇壓力等[29]。在一些生物的基因組中，基因表達(dá)水平與密碼子使用偏好性之間存在著顯著相關(guān)關(guān)系[42-43]。在描述ENC值與基因表達(dá)的反比例關(guān)系時，Wright[16]認(rèn)為低的ENC值意味著更多的密碼子使用偏好性和更高的基因表達(dá)水平。本研究通過中性繪圖分析發(fā)現(xiàn)，Claudin家族基因的密碼子使用模式更多地受到突變壓力影響。在這些分析基礎(chǔ)上，得出如下結(jié)論：除了單個基因的核苷酸組成，突變壓力也是影響Claudin家族基因密碼子使用模式的重要因素。

在目前的分子序列聚類方法中，密碼子RSCU值聚類和CDS聚類被廣泛應(yīng)用于同一物種的不同基因進(jìn)化關(guān)系分析[41]。這2種聚類分析方法在有些物種中分析結(jié)果一致[44]，有些卻相差甚遠(yuǎn)[45]。為進(jìn)一步揭示Claudin家族22個基因的真實(shí)系統(tǒng)分類，本研究基于密碼子RSCU值和CDS序列分別進(jìn)行了聚類。RSCU聚類結(jié)果顯示Claudin-1和Claudin-20、Claudin-25聚為一類。CDS序列聚類結(jié)果顯示Claudin-3和Claudin-4較為接近，Claudin-10和Claudin-11較為接近。2種分析的聚類結(jié)果不一致，因此需要進(jìn)一步分析基因功能。Wolburg等[46]發(fā)現(xiàn)Claudin-3是決定體內(nèi)血腦屏障緊密連接的主要成分，而張慧慧等[47]發(fā)現(xiàn)Claudin-4基因表達(dá)量下降后，血腦屏障通透性增加，其完整性遭到破壞，說明Claudin-3和Claudin-4在血腦屏障功能的維持中發(fā)揮著相同的作用。促癌因子、肝細(xì)胞生長因子和表皮生長因子能夠降低Claudin-7的表達(dá)，增加Claudin-3和Claudin-4的表達(dá)[48-49]，進(jìn)一步說明Claudin-3和Claudin-4在基因的表達(dá)上應(yīng)該歸為一類。啟動子甲基化可導(dǎo)致Claudin-7基因沉默，并且Claudin-7低表達(dá)可能在結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)Claudin-19可能與腎臟疾病相關(guān)，在人多囊腎組織中Claudin-19表達(dá)下降和定位失調(diào)[50]，提示Claudin-7和Claudin-19在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用一致。綜上分析發(fā)現(xiàn)，基于CDS的系統(tǒng)進(jìn)化樹更接近這22個基因的真實(shí)系統(tǒng)分類，表明同一基因家族不同基因的密碼子使用特性也存在差異，功能越相近的基因其密碼子使用模式也越接近。提示我們今后對基因的分類不能只局限于對堿基序列組成的分析，也要結(jié)合基因功能等進(jìn)行綜合分析。

同義密碼子相對使用度分析作為衡量密碼子偏好使用的重要參數(shù)，可用于發(fā)現(xiàn)使用頻率較高的密碼子[51]。RSCU值大小反映了密碼子使用的正負(fù)偏向程度[52]。本研究通過計算Claudin家族22個基因相對密碼子使用度，發(fā)現(xiàn)23個高頻密碼子中，CUG、AUC、GUG、UCC、CCC、ACC、GCC、CAG、CGC、CGG、GGC這11個密碼子RSCU值大于1.6，偏好性較強(qiáng)。多項(xiàng)研究表明，對基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化有助于提高基因表達(dá)量，促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞中蛋白的高效表達(dá)[53]。豬Claudin家族基因作為組成細(xì)胞之間緊密連接的重要結(jié)構(gòu)基因，在細(xì)胞極性的維持及腸道黏膜屏障功能的發(fā)揮中起著重要作用[11]。Claudins表達(dá)量降低會導(dǎo)致組織滲透屏障遭到破壞，細(xì)胞極性消失，使得豬更易感染PEDV進(jìn)而引起腹瀉。因此，通過對本研究發(fā)現(xiàn)的11個最優(yōu)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，可以改善基因GC水平，去除低頻密碼子，有利于增加密碼子編碼氨基酸的效率和豐度，進(jìn)而提高Claudin家族基因在豬體內(nèi)的表達(dá)，維持腸道黏膜屏障的完整性，為增強(qiáng)機(jī)體對病原菌的抵抗力奠定基礎(chǔ)，也為今后對Claudin基因進(jìn)行功能驗(yàn)證提供了技術(shù)指導(dǎo)。