梁永紅 馮超 周忠信

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院介入血管外科（廣州 510630）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是我國較為常見的惡性腫瘤［1-2］。因肝癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，很多肝癌被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后［3-4］。因此，進(jìn)一步闡明肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制，是肝癌防治的熱點。鈣庫依耐性Ca2+內(nèi)流（store-operated Ca2+entry，SOCE）是細(xì)胞外鈣內(nèi)流的主要通道，既往的研究發(fā)現(xiàn)抑制SOCE可減少肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移［5-6］。熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，Hsp90）是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白折疊、穩(wěn)定等的重要蛋白，分為Hsp90α、Hsp90β、Grp94、TRAP1四種亞型［7-8］。其分泌到細(xì)胞外的 Hsp90α（extracellular Hsp90α，eHsp90α）被證實與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)［9-10］，但其在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制目前尚未見報道，是否可以調(diào)控SOCE也未有報道。因此，本研究皆指著探討eHsp90α對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，并探討其中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料50 kDa超濾管（Merck公司，愛爾蘭），人重組 Hsp90α（hrHsp90α）（StressMarq公司，英國），Transwell小室（Corning公司，美國），F(xiàn)luo-4（同仁公司，日本），Hsp90α兔來源多克隆一抗（Abcam公司，美國），STIM1兔來源多克隆一抗（sigma公司，美國），STIM1鼠來源多克隆一抗（abcam公司，美國），ORAI1兔來源多克隆一抗（sigma公司，美國），β-actin鼠來源單克隆一抗（CST公司，美國），抗兔或鼠HRP標(biāo)記二抗（中杉金橋，北京），抗兔或鼠熒光標(biāo)記二抗（life，美國），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（吉諾公司，中國），Lipofectamine?2000 Reagent（invitrogen，美國）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)正常肝細(xì)胞系LO-2和肝癌細(xì)胞系 HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H 和 HCCLM3由南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗室保留細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞上清濃縮5 mL預(yù)冷的PBS加入超濾管，4℃、1 000 g/min、5 min離心以激活超濾管。棄超濾管中PBS，加入收集的上清液。4℃、5 000 g/min，離心時間視情況而定，至上室液體量為100～200 μL時。棄超濾出的液體，加入1 mL的預(yù)冷的PBS，用移液槍進(jìn)行仔細(xì)吹打，由上而下，反復(fù)吹打5 min，再加入預(yù)冷的PBS定容到5 mL。同樣的條件下進(jìn)行離心。如此用PBS置換2次。最后一次超濾至液體剩余50 μL以下。最后用移液槍進(jìn)行仔細(xì)吹打，由上而下，反復(fù)吹打5 min，回收液體，加入預(yù)冷的PBS定容至50 μL。再加入5 × Loading buffer 12.5 μL，放入沸水中，震蕩煮沸10 min。樣品凍-20℃，后續(xù)Western blot檢測Hsp90α。

1.2.3小干擾RNA轉(zhuǎn)染si-STIM1和對照si-NC小干擾RNA轉(zhuǎn)染由上海吉瑪生物公司合成。si-STIM1干擾系列：AGGTGGAGGTGCAATATTA，si-NC干擾系列：AATTCTCCGAACGTGTCACGT。轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine?2000 Reagent說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測效率。

1.2.4Western blot檢測提取全細(xì)胞胞漿蛋白，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后-20℃保存。SDS-PAGE 膠分離蛋白（90 V，1.5 h），轉(zhuǎn)膜（冰浴，90V，2 h），封閉（5% 脫脂奶粉，常溫，2 h），STIM1、ORAI1、Hsp90α、β-actin一抗（1∶1 000）4 ℃過夜孵育，二抗（1∶5 000）常溫1 h，TBST 5 min/次×3次洗膜后ECL顯影。

1.2.5Transwell實驗50 mg/L Matrigel 1∶5稀釋，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。使用前用上室加入100 μL無血清培養(yǎng)基DMEM 37℃濕化30 min。細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)基DMEM制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL。吸取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min后，結(jié)晶紫染色2 h，顯微鏡下拍照。

1.2.6劃痕實驗先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。細(xì)胞種于6孔板中，細(xì)胞長至95%后饑餓24 h。用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0和24 h取樣，拍照。

1.2.7SOCE活性細(xì)胞1×105個種于confocal小皿中，處理好后37℃Hank液洗3次，加入Fluo-4（1∶200）37℃、避光染色30 min。D-Hank液洗3次，加入200 μL D-Hank液。Confocal檢測熒光值變化。1.2.8免疫熒光細(xì)胞種于confocal皿中，處理好后TG室溫刺激10 min。PBS洗一次，4%多聚甲醛室溫固定10 min。PBS洗3次，加入0.25%曲拉通室溫通透10 min。5%BSA封閉30 min，加入1∶100的SITM1（鼠來源）和ORAI1（兔來源）一抗，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入抗兔和抗鼠的熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h。PBS避光洗3次，加入DAPI避光孵育5 min。PBS避光洗3次，confocal拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義后進(jìn)一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1eHsp90α促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移檢測正常肝細(xì)胞系LO-2和肝癌細(xì)胞系HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H和HCCLM3培養(yǎng)基上清中eHsp90α的水平，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系中eHsp90α較正常肝細(xì)胞系顯著增加；高度轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H和HCCLM3細(xì)胞中eHsp90α較低轉(zhuǎn)移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高（圖1A）。同時，運用hrHsp90α刺激低轉(zhuǎn)移能力的HepG2，發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進(jìn)HepG2轉(zhuǎn)移（圖1B、1C）。提示，eHsp90α有促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

圖1 eHsp90α對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響Fig.1 The effect of eHsp90α on hepatocellular carcinoma cells metastasis

2.2 SOCE調(diào)控肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移SOCE作為細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的主要方式，在很多腫瘤細(xì)胞中都有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移的作用。因此，通過檢測肝癌細(xì)胞系SOCE的水平，發(fā)現(xiàn)高度轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H和HCCLM3細(xì)胞中SOCE的活性較低轉(zhuǎn)移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高（圖2A）。同時也觀察到，SOCE的關(guān)鍵蛋白STIM1標(biāo)準(zhǔn)在MHCC87H和HCCLM3細(xì)胞中的表達(dá)較HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高，但ORAI1蛋白表達(dá)差異不大（圖2B和2C）。進(jìn)一步用SOCE抑制劑2-APB和SKF-98059（SKF）抑制SOCE的活性及鈣離子拮抗劑EGTA（圖2D），可以顯著抑制MHCC87H的高轉(zhuǎn)移能力（圖2E）。由此提示，SOCE的活性影響肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

2.3 下調(diào)STIM1表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移在高轉(zhuǎn)移并高表達(dá)STIM1的MHCC87H細(xì)胞系中，下調(diào)STIM1表達(dá)后（圖3A）可減少SOCE活性（圖3B）、STIM1和ORAI1的相互作用（圖3C）；同時也發(fā)現(xiàn)MHCC87H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制（圖3D）。STIM1高表達(dá)可增加SOCE的活性，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

2.4 STIM1在eHsp90α促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用hrHsp90α處理的HepG2細(xì)胞STIM1表達(dá)顯著升高（圖4A），SOCE活性（圖4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平增加（圖4C），細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)（圖4D）；而通過siRNA抑制STIM1增高后（圖4A），增加的SOCE活性（圖4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平被抑制（圖4C），增高的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力也被抑制（圖4D）。提示，eHsp90α通過上調(diào)STIM1表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

3 討論

通過上述的研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中eHsp90α較正常肝細(xì)胞顯著增加，并且高度轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞中eHsp90α水平、STIM1蛋白表達(dá)和SOCE活性較低轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞顯著升高。同時還發(fā)現(xiàn)eHsp90α通過增強(qiáng)SOCE活性促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

Hsp90是細(xì)胞內(nèi)參與蛋白折疊和穩(wěn)定的重要蛋白，大量的研究證明Hsp90在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，參了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11-12］。但因Hsp90在細(xì)胞正常生理中有重要作用，通過抑制Hsp90的活性來治療腫瘤的同時出現(xiàn)嚴(yán)重副作用［13-14］。而新近的研究發(fā)現(xiàn)，分泌到細(xì)胞外的Hsp90有Hsp90α和Hsp90β。DONG等［9］的研究報道顯示，細(xì)胞外的Hsp90α（即eHsp90α）有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。并且，eHsp90α在腫瘤細(xì)胞外大量存在，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞系中eHsp90α較正常肝細(xì)胞系顯著增加；高轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H和HCCLM3細(xì)胞中eHsp90α較低轉(zhuǎn)移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高。并且，用hrHsp90α誘導(dǎo)低轉(zhuǎn)移性的HepG2細(xì)胞可以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力。由此提示，eHsp90α可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

圖2 激活的SOCE促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移Fig.2 Activated SOCE promotes liver cancer cell metastasis

圖3 STIM1在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用Fig.3 The effect of STIM1 on hepatocellular carcinoma cells metastasis

圖4 STIM1在eHsp90α促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用Fig.4 The role of STIM1 in eHsp90α promoting hepatoma cell metastasis

SOCE的細(xì)胞外鈣內(nèi)流到細(xì)胞內(nèi)的主要途徑，在乳腺癌［15-16］、肺癌［17］、骨肉瘤［18］、肝癌［19］等腫瘤中均證實SOCE參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。通過對比低轉(zhuǎn)移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H、HCCLM3細(xì)胞的SOCE活性，本研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H、HCCLM3細(xì)胞的SOCE活性顯著高于低轉(zhuǎn)移能力的 HepG2、HL-7702、SNU-449細(xì)胞。并且，抑制SOCE的活性可以抑制MHCC87H的轉(zhuǎn)移能力。

SOCE主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STIM1蛋白激活細(xì)胞膜上的鈣離子通道ORAI1，誘導(dǎo)外鈣內(nèi)流［20］。在高轉(zhuǎn)移能力的MHCC87H、HCCLM3細(xì)胞中，STIM1蛋白的表達(dá)較低轉(zhuǎn)移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449細(xì)胞明顯增加，但高低轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系中ORAI1蛋白表達(dá)沒有差異。SAINT［21］和吳冰［22］等也均發(fā)現(xiàn)STIM1蛋白高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲低MHCC87H細(xì)胞STIM1蛋白表達(dá)后，其轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。說明肝癌細(xì)胞中STIM1蛋白表達(dá)的差異導(dǎo)致SOCE活性的不同，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，在eHsp90α誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中，其SOCE活性顯著增強(qiáng)，STIM1蛋白表達(dá)增多；但敲低增加的STIM1蛋白，eHsp90α誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加的作用被抑制。

綜上所述，肝癌細(xì)胞通過大量分泌eHsp90α，誘導(dǎo)STIM1蛋白表達(dá)，增加SOCE活性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這對進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制有一定的幫助。但eHsp90α是如何促進(jìn)STIM1蛋白表達(dá)及SOCE激活后是如何促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的還需要進(jìn)一步研究。