何政 吳慧 鄭軍

三峽大學第一臨床醫(yī)學院宜昌市中心人民醫(yī)院肝膽胰外科（湖北宜昌443002）

膽囊癌（gallbladder cancer，GBC）是指發(fā)生于膽囊及膽囊管的惡性腫瘤，其發(fā)病率在消化道腫瘤中位居第六，由于其起病隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，患者中位生存期僅有6個月［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約17～25個核苷酸的短鏈非編碼RNA，通過與mRNA上3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，阻止mRNA翻譯或?qū)е缕浣到?，以此來調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達［2-3］。其在免疫調(diào)節(jié)、細胞分化、腫瘤形成等過程中均發(fā)揮著重要的作用［4-5］。目前，miRNA在腫瘤中的作用不盡相同，一些miRNA直接作用于具有促凋亡或抗增殖作用的基因轉(zhuǎn)錄本而表現(xiàn)出促進腫瘤進展的作用，相反，表現(xiàn)為抑制腫瘤作用的miRNA則被證實能夠抑制控制細胞分化或凋亡的基因的表達［6］。在膽囊癌中，miR-155、miR-20a和miR-182被鑒定為是促進腫瘤進展的調(diào)控因子［7-9］。而另一些miRNA如miR-135a、miR-26a以及miR-146b-5p則表現(xiàn)為抑制膽囊癌的發(fā)展［10-12］。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）被認為是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因［13-14］。有研究表明在乳腺癌中，miR-181b-3p能促進這一過程，并參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［15］。因此研究miR-181b-3p在膽囊癌中的表達及與EMT的關(guān)系至關(guān)重要。本研究通過體外細胞學實驗分析miR-181b-3p對于膽囊癌細胞侵襲和遷移能力的影響，揭示miR-181b-3p在膽囊癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1組織標本、細胞株來源和制劑人膽囊癌細胞株GBC-SD由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室饋贈；人膽囊癌組織及正常組織來自三峽大學第一臨床醫(yī)學院肝膽胰外科病區(qū)8例膽囊癌患者。所有患者均簽署由醫(yī)院倫理委員會批準的患者知情同意書，符合醫(yī)學倫理學規(guī)定。所有標本均在離體后30 min內(nèi)置于液氮罐凍存，標本均經(jīng)過病理學切片確診。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；miR-181b-3p的模擬物（mimic，正義鏈為：CUCACUGAACAAUGAAUGCAA）、抑制物（inhibitor，序列為GAGUGACUUGUUACUUACGUU）及對照序列（NC，UUUGUACUACACAAAAGUACUG）由廣州銳博生物科技有限公司負責構(gòu)建；PCR相關(guān)SYBR Premix試劑購自Takara公司；Trizol、Lipofectamine2000購自美國賽默飛公司；Transwell小室及六孔板購自美國Corning公司；Vimentin、E-cadherin、GAPDH抗體購自美國CST公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人膽囊癌細胞系GBC-SD在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2的條件下，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基或進行細胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2PCR檢測正常及膽囊癌組織中RNA表達量充分剪碎組織，每1 mL Trizol加入200 μL，充分震蕩后離心，取上層液相于新的Ep管并加入1 mL異丙醇，離心后棄上清，得到的產(chǎn)物加入1 mL 75%乙醇進行洗滌，離心后得到RNA自然晾干，用無酶水溶解，得到正常及膽囊癌組織RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄體系（莖環(huán)法），用PCR儀按如下條件反應(yīng)：預(yù)變性，95℃，20 s；變性，95 ℃，10 s；退火，60 ℃，20 s；延伸，70 ℃，10 s；40個循環(huán)，每個樣本的目的基因與內(nèi)參基因U6的循環(huán)閾值的差異為△Ct，處理組與對照組△Ct的差異值為△△Ct。以2-△△Ct來表示基因的相對表達量，檢測miR-181b-3p在正常及膽囊癌組織中的表達情況。

1.2.3miR-181b-3p模擬物及抑制物的轉(zhuǎn)染選取處于對數(shù)生長期的GBC-SD細胞制備細胞懸液，以密度3.5×105個/mL接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至70%左右時，分別將模擬物、抑制物及對照轉(zhuǎn)染入每個皿中，分別設(shè)為miR-181b-3p過表達組、低表達組及對照組。24 h時換液，48 h時提取RNA，通過PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4Trasnwell小室侵襲實驗Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1∶8稀釋，加入小室上室面，于37℃30 min水化基底膜。制備轉(zhuǎn)染48 h后的GBCSD細胞懸液（用不含血清的培養(yǎng)基重懸），密度為2× 105個/mL，每個小室中加入200 μL，下室加入含10%血清的培養(yǎng)基600 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h后用PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用棉簽擦去上室面細胞，顯微鏡拍照并統(tǒng)計。

1.2.5波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達測定依據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染48～72 h后的GBCSD細胞蛋白，檢測蛋白濃度并計算上樣量，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過夜、二抗37℃孵育2 h及化學發(fā)光等步驟，圖片采用Image Lab軟件分析灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析、整理。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，方差檢驗齊性，兩組比較采用t檢驗，Transwell實驗結(jié)果3組比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1miR-181b-3p在膽囊癌組織及癌旁組織中的表達PCR結(jié)果顯示，8例膽囊癌組織中miR-181b-3p相對表達量（9.22±5.74）明顯高于對應(yīng)的正常組織（2.54±1.27），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.213，P=0.006 3，圖1）。

圖1 8例膽囊癌組織及正常組織中miR-181b-3p相對表達量Fig.1 Relative expression of miR-181b-3p in gallbladder carcinoma and paired normal tissues（8 cases）

2.2 細胞轉(zhuǎn)染效率檢測將構(gòu)建好的miR-181b-3p模擬物、抑制物及對照分別轉(zhuǎn)染入GBC-SD細胞系中，48 h后提取RNA并用PCR進行驗證，結(jié)果顯示過表達組相對表達量（423.10±77.64）明顯高于對照組的1（t=9.432，P=0.011 1；圖2A）；低表達組相對表達量（0.32±0.05）明顯低于對照組的1（t=9.416，P=0.002 0；圖2B），證實其模擬物可以有效增加GBC-SD細胞miR-181b-3p的表達，而抑制物可以有效減低其表達。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-181b-3p模擬物、抑制物及對照組轉(zhuǎn)染后GBC-SD細胞中miR-181b-3p的相對表達量Fig.2 Relative expression of miR-181b-3p in GBC-SD cells when transfected with miR-181b-3p mimic，inhibitor and control

2.3 Transwell實驗檢測miR-181b-3p對GBC-SD侵襲能力的影響Transwell實驗結(jié)果表明，在膽囊癌細胞系GBC-SD中，過表達組侵襲轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)量為（811.40±179.53）個，明顯高于對照組的（231.00 ± 61.22）個（LSD-t=8.357，P=0.000 9）；而低表達組侵襲轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)量為（28.80±13.81）個，明顯低于對照組的（231.00±61.22）個（LSD-t=2.912，P=0.001 2；圖3）。

圖3 miR-181b-3p對膽囊癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.3 Effect of miR-181b-3p on invasion of GBC-SD cells（× 100）

2.4 Western blot檢測波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達對轉(zhuǎn)染了miR-181b-3p模擬物、抑制物及對照的GBC-SD細胞進行Western blot檢測，結(jié)果顯示相比于對照組過表達組波形蛋白表達增多，E-鈣黏蛋白表達減少；而低表達組波形蛋白表達減少；E-鈣黏蛋白表達增多（圖4）。

2.5 組織中E-鈣黏蛋白與miR-181b-3p表達的相關(guān)關(guān)系通過對組織中miR-181b-3p與E-鈣黏蛋白表達量的檢測發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白的表達與組織中miR-181b-3p的含量呈負相關(guān)關(guān)系（圖5）。

圖4 miR-181b-3p對GBC-SD細胞中波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達的影響Fig.4 Effect of miR-181b-3p on the expression of vimentin and E-cadherin in GBC-SD cells

圖5 8例膽囊癌組織中E-鈣黏蛋白表達與miR-181b-3p含量的相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between expression of E-cadherin and miR-181b-3p in gallbladder carcinoma tissues（8 cases）

3 討論

膽囊癌是一類惡性程度極高的腫瘤，其進展隱匿而迅速，易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，使得大部分膽囊癌在發(fā)現(xiàn)時就已屬于晚期，5年總生存率僅為5%［16］。研究認為，miRNA在癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［17］。miR-181b-3p定位于人類基因組1號染色體，大小為21 bp，基因序列為CUCACUGAACAAUGAAUGCAA［18］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-181家族與白血病、肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［19-20］。在乳腺癌中，miR-181b-3p可能促進了乳腺癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而增強了其侵襲轉(zhuǎn)移能力［15］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等細胞黏附分子表達的減少以及細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）為主的細胞骨架是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的顯著特征［21-23］。本研究通過檢測膽囊癌組織中miR-181b-3p、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達量，著重探究miR-181b-3p與膽囊癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系及其在膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。

本研究通過PCR檢測正常膽囊組織與膽囊癌組織中的miR-181b-3p表達情況，首次闡明了膽囊癌組織中的miR-181b-3p含量明顯高于正常組織。通過構(gòu)建miR-181b-3p模擬物及抑制物，本研究實現(xiàn)了膽囊癌細胞中miR-181b-3p的上調(diào)與下調(diào)，并且通過Transwell實驗，進一步證明過表達miR-181b-3p能顯著提高膽囊癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而下調(diào)miR-181b-3p降低了其侵襲轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果提示miR-181b-3p在膽囊癌中扮演了促進侵襲轉(zhuǎn)移的角色。在LIU等［24］的研究中，miR-181b直接作用于HMGB1并且是一個抑制非小細胞肺癌侵襲的調(diào)節(jié)因子。ZHOU等［25］也發(fā)現(xiàn)miR-181b能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲。雖然上述研究與本研究結(jié)果不同，但是考慮到腫瘤擁有各自獨特的性質(zhì)，其同一個因子也并非單一調(diào)控下游靶基因，因此miRNA對腫瘤侵襲的調(diào)控可能會有不同的結(jié)果。本研究還證實miR-181b-3p能升高波形蛋白的表達，同時減少E-鈣黏蛋白的表達。通過進一步研究膽囊癌組織中miR-181b-3p與E-鈣黏蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白的表達與組織中miR-181b-3p的含量呈負相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果有力證實，miR-181b-3p促進了膽囊癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而增強了其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，EMT是膽囊癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要方式。miR-181b-3p在膽囊癌組織中高表達，其通過促進膽囊癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進其侵襲轉(zhuǎn)移。因此干預(yù)miR-181b-3p的表達并通過其調(diào)控EMT可對腫瘤進展過程產(chǎn)生關(guān)鍵性影響，進而可能提高患者生存率。miR-181b-3p在膽囊癌的惡性進展中扮演著的重要調(diào)控角色，有望成為膽囊癌診治的靶點之一。遺憾的是，miRNA靶向降解目標基因的RNA從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的功能，而本研究尚未進行miR-181b-3p靶基因的尋找和其功能的鑒定。miR-181b-3p在調(diào)節(jié)膽囊癌侵襲發(fā)生的機制仍有待進一步闡明。