■楊 洋 權(quán)志中 呂秋鳳* 楊 寧 李曉玲 王 楠 董公麟 呂允濤

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110161；2.沈陽市康普利德生物科技有限公司，遼寧沈陽110161；3.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧鐵嶺112611)

蛋白質(zhì)是動物飼料中非常重要的營養(yǎng)源，但受不同蛋白飼料來源和動物的不同生理階段(如斷奶、疾病、應(yīng)激條件下)影響，機(jī)體對蛋白質(zhì)的消化、吸收往往存在一定的障礙，因此，對蛋白原料進(jìn)行體外預(yù)消化處理十分必要。飼料預(yù)消化處理即采用體外模擬動物消化過程，根據(jù)不同原料所具有的不同特征進(jìn)行一定的加工處理，使其轉(zhuǎn)變成易于動物機(jī)體吸收的營養(yǎng)成分，同時消除原料中有毒有害物質(zhì)，提高機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用的一種新型飼料加工技術(shù)[1]。

目前對蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)的消化吸收機(jī)制的理論解釋中，公認(rèn)的主流學(xué)說是蛋白質(zhì)在腸道的吸收主要以氨基酸和小肽為主，大分子蛋白必須通過動物機(jī)體的酶解作用才能夠被小腸吸收利用，這是一個生物耗能過程。研究表明，斷奶、疾病等應(yīng)激條件下，動物腸黏膜形態(tài)發(fā)生改變、絨毛受損、黏膜細(xì)胞能量供應(yīng)不足，就會引起上皮細(xì)胞損傷及其功能紊亂，進(jìn)而降低機(jī)體對營養(yǎng)素的吸能力。飼糧谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸是小腸黏膜的主要燃料，為營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等腸道ATP依賴性的代謝過程提供能量。通過向豬十二指腸灌注小肽后，血漿胰島素的濃度高于灌注游離氨基酸，而胰島素的生理功能之一即參與蛋白質(zhì)合成中肽鏈的延伸，增加蛋白質(zhì)的合成。王恬等[2]研究發(fā)現(xiàn)小肽能刺激小腸絨毛增生，促進(jìn)幼齡動物小腸發(fā)育成熟。這些研究提示我們在動物腸道營養(yǎng)中氨基酸和小肽均有作用，且有可能存在互作。蛋白質(zhì)預(yù)消化處理后的產(chǎn)物主要由氨基酸和小肽以及一些生物大分子組成，較早期的研究表明可以改善動物的生長性能，但這些混合成分對腸道健康的影響機(jī)制并不清楚。腸道作為消化器官直接與外界相通，而腸道黏膜系統(tǒng)作為機(jī)體最大的非特異性免疫器官，其功能狀態(tài)直接影響機(jī)體的免疫水平。因此，研究蛋白質(zhì)預(yù)消化處理產(chǎn)物對腸道組織形態(tài)學(xué)以及機(jī)體免疫能力的影響十分必要。本研究旨在通過觀察預(yù)消化蛋白對小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、免疫器官指數(shù)、腸黏膜SIgA等免疫指標(biāo)的影響，為預(yù)消化蛋白在動物生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

預(yù)消化蛋白購于沈陽市康普利德生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動物

SPF(Specific pathogen free，無特定病原體級)小鼠，體重18～22 g，雄性，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分組：取小鼠240只，隨機(jī)分成3組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)20只。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)一組的日糧中預(yù)消化蛋白添加量為2.5%，試驗(yàn)二組的日糧中預(yù)消化蛋白添加量為5%，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 飼養(yǎng)管理

小鼠自由采食，每天換水1次，每周更換墊料2次，消毒2次，環(huán)境溫度20～30℃。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 十二指腸形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定

試驗(yàn)進(jìn)行6周后，每個處理的每個重復(fù)隨機(jī)選取3只小鼠，剪取十二指腸中段腸管3 cm，用蒸餾水輕輕洗凈內(nèi)容物后，立即置于固定液中固定。采用HE染色法染色，以IAS.BV4.4圖像軟件分析，測定絨毛長度和隱窩深度，計(jì)算絨毛長度/隱窩深度比值。

1.3.2 小鼠免疫器官指數(shù)測定

試驗(yàn)過程中，每周從每個重復(fù)組中隨機(jī)取出1只健康小鼠，稱重后采用頸椎脫臼的方法將小鼠處死，分離脾臟和胸腺，用濾紙吸干水分后分別稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.3.3 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力指標(biāo)測定

采用臺盼藍(lán)染色法，試驗(yàn)飼養(yǎng)周期結(jié)束的前2 d，從每個處理組每個重復(fù)中隨機(jī)取3只小鼠，分別用注射器抽取1 ml臺盼藍(lán)染色液注入小鼠腹腔內(nèi)并將小鼠進(jìn)行標(biāo)記。試驗(yàn)結(jié)束后，抽取上述標(biāo)記小鼠的腹腔液于鏡下觀察并記錄不同視野下100個吞噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和被巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 小腸黏膜SIgA表達(dá)水平的測定

試驗(yàn)過程中，每周從每個重復(fù)組中隨機(jī)選出1只小鼠，宰殺解剖后分別切取十二指腸段、空腸段、回腸段各3 cm左右。按照ELISA試劑盒使用說明書通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測定腸道黏膜SIgA的表達(dá)水平。試劑盒購置于德國IBI分裝公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用IDE和Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)學(xué)的影響(見表2、圖1)

表2 預(yù)消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)學(xué)的影響

圖1 預(yù)消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)的影響

由表2可知，試驗(yàn)組小鼠十二指腸絨毛長度與對照組相比分別提高11.31%和8.84%(P＜0.05)，試驗(yàn)組小鼠十二指腸絨毛長度/隱窩深度與對照組相比分別提高18.32%和14.66%(P＜0.05)，試驗(yàn)組隱窩深度與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，但有降低趨勢。試驗(yàn)組之間的小鼠十二指腸絨毛長度、隱窩深度及V/C均差異不顯著(P＞0.05)。綜上所述，預(yù)消化蛋白可以顯著提高小鼠十二指腸絨毛長度和絨毛長度/隱窩深度比值(P＜0.05)，有降低隱窩深度的趨勢(P＞0.05)。

圖1顯示，對照組小鼠十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列疏松，但絨毛長度不均等；試驗(yàn)一組的絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列緊密、長度增長且均等、隱窩深度降低；試驗(yàn)二組絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列緊密，但絨毛長度不均等。

2.2 預(yù)消化蛋白對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響(見表3)

表3 預(yù)消化蛋白對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響

由表3可知，試驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率與對照組相比均顯著提高(P＜0.05)，其中試驗(yàn)一組的吞噬率與對照組相比提高了14.56%，試驗(yàn)二組吞噬率與對照組相比提高了6.27%，且兩個試驗(yàn)組之間差異顯著(P＜0.05)。但試驗(yàn)組的吞噬指數(shù)與對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)。

2.3 預(yù)消化蛋白對小鼠免疫器官指數(shù)的影響(見表4)

表4 預(yù)消化蛋白對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表4可知，在整個試驗(yàn)過程中，對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)逐漸降低，各試驗(yàn)組的脾臟指數(shù)先升高后降低，而胸腺指數(shù)逐漸降低，但降低速度緩慢。試驗(yàn)一組脾臟指數(shù)與對照組相比的優(yōu)勢逐漸增強(qiáng)，并在試驗(yàn)進(jìn)行6周后優(yōu)勢達(dá)到最優(yōu)，比對照組提高21.00%(P＜0.05)；試驗(yàn)二組在試驗(yàn)進(jìn)行3周后脾臟指數(shù)與對照組相比優(yōu)勢最強(qiáng)，與對照組相比提高14.50%(P＜0.05)，之后降低，但整體均優(yōu)于對照組；試驗(yàn)組胸腺指數(shù)與對照組相比均有提高，其中試驗(yàn)進(jìn)行6周后試驗(yàn)組胸腺指數(shù)與對照組相比分別提高17.69%和13.08%(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果證明，預(yù)消化蛋白能夠提高小鼠免疫器官指數(shù)，提高機(jī)體非特異性免疫水平。

2.4 預(yù)消化蛋白對小鼠腸黏膜SIgA的影響(見表5)

表5 預(yù)消化蛋白對小鼠腸黏膜SIgA的影響(ng/ml)

由表5可知，試驗(yàn)過程中，小鼠十二指腸黏膜SI-gA表達(dá)水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，前3周逐漸上升，第4周忽然降低后又逐漸上升。總體來看，試驗(yàn)組與對照組相比，除1周后試驗(yàn)二組十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水平略低于對照組，其余時間段試驗(yàn)組均高于對照組。其中試驗(yàn)進(jìn)行2周后，試驗(yàn)二組十二指腸腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比有所提高（P＞0.05），并與試驗(yàn)進(jìn)行的4周后達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，至6周后雖仍高于對照，但差異已趨平緩(P＞0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行2周后，試驗(yàn)一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水平提高7.89%(P＜0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行3周后，試驗(yàn)一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水平提高了13.18%(P＜0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行4周后，試驗(yàn)組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水平分別提高了13.78%和6.73%(P＜0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行5周后，試驗(yàn)組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水平分別提高26.19%和9.58%(P＜0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行6周后，試驗(yàn)一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達(dá)水提高14.56%(P＜0.05)，在試驗(yàn)進(jìn)行2周到6周期間，兩個試驗(yàn)組之間差異均顯著(P＜0.05)。

小鼠空腸黏膜SIgA表達(dá)水平的動態(tài)變化趨勢與十二指腸表現(xiàn)基本一致。試驗(yàn)進(jìn)行1周后，試驗(yàn)一組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比提高了23.85%(P＜0.05)，試驗(yàn)二組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行2周后，兩個試驗(yàn)組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比分別提高了22.31%和9.14%(P＜0.05)；試驗(yàn)進(jìn)行3周后，試驗(yàn)一組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平顯著高于對照組，提高5.44%(P＜0.05)，而試驗(yàn)組二空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，兩試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)；試驗(yàn)進(jìn)行4周后，試驗(yàn)組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比分別提高了19.99%和6.37%(P＜0.05)，且試驗(yàn)組之間差異顯著(P＜0.05)；試驗(yàn)進(jìn)行5周后，試驗(yàn)組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比分別提高了18.40%和8.93%(P＜0.05)，且試驗(yàn)組之間差異顯著(P＜0.05)。試驗(yàn)進(jìn)行6周后，試驗(yàn)組空腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比分別提高了10.00%和9.29%(P＜0.05)，且試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。

小鼠回腸黏膜SIgA的變化趨勢也與十二指腸表現(xiàn)基本一致。試驗(yàn)進(jìn)行1周后，試驗(yàn)組回腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)；試驗(yàn)進(jìn)行2周到6周中，試驗(yàn)組回腸黏膜SIgA表達(dá)水平與對照組相比均顯著提高，由2周到6周試驗(yàn)組依次分別提高了11.69%和6.64%(P＜0.05)、24.58%和13.49%(P＜0.05)、18.26%和 17.74%(P＜0.05)、8.41%和 6.87%(P＜0.05)、10.72%和9.86%(P＜0.05)，其中飼喂3周時回腸SIgA表達(dá)水平提高最多。

3 討論

3.1 預(yù)消化蛋白對腸道形態(tài)學(xué)的影響

王恬等[2]在小肽營養(yǎng)素對斷奶仔豬小腸發(fā)育的影響中研究表明，小肽能刺激小腸絨毛增生,促進(jìn)幼齡動物小腸的發(fā)育成熟。斷奶仔豬日糧中添加小肽營養(yǎng)素可以減輕由于仔豬斷奶后引起的小腸絨毛萎縮,刺激仔豬腸道組織與功能的發(fā)育，改善十二指腸的形態(tài)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。祝平等[3]在植物小肽對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響中研究表明，植物小肽能夠促進(jìn)仔豬在斷奶后腸道形態(tài)完整性，提高仔豬腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，這種趨勢隨著植物小肽添加量的增加而提高。這些試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果具有一致性。本試驗(yàn)結(jié)果證明，預(yù)消化蛋白可以提高腸絨毛長度和V/C比值，降低隱窩深度，促進(jìn)腸道形態(tài)的完整，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠的免疫能力。

3.2 預(yù)消化蛋白對巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響

吞噬細(xì)胞的吞噬作用是非特異性免疫的重要組成部分。因此測定機(jī)體吞噬細(xì)胞的能力對了解機(jī)體的免疫功能具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)中，預(yù)消化蛋白組的巨噬細(xì)胞吞噬率均高于對照組，三組之間具有顯著差異，且以2.5%組表觀更優(yōu)，李紅勝[4]在大豆肽的制備及其小鼠免疫功能的影響中試驗(yàn)結(jié)果表明，添加大豆肽可以提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與本試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)一致。說明預(yù)消化蛋白可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高小鼠自身的非特異性免疫能力。由于非特異性免疫力是特異性免疫的基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)可以促進(jìn)血液中免疫球蛋白的表達(dá)，繼而提高機(jī)體的免疫能力。

3.3 預(yù)消化蛋白對免疫器官指數(shù)的影響

試驗(yàn)過程中，小鼠的脾臟指數(shù)呈現(xiàn)動態(tài)變化，整體表現(xiàn)平穩(wěn)，沒有大起大落，說明在小鼠的正常生長周期中，不會出現(xiàn)免疫亢進(jìn)或免疫抑制的情況，免疫功能逐漸完善并趨于穩(wěn)定。添加預(yù)消化蛋白的兩組脾臟指數(shù)從第2周開始顯著高于對照組，且以試驗(yàn)一組表現(xiàn)更優(yōu)。脾臟是機(jī)體中最大的免疫器官，是免疫應(yīng)答的重要場所。脾臟內(nèi)富含有B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。B細(xì)胞對血清中抗體水平尤其是IgM和IgG的表達(dá)水平具有很大作用。

從胸腺指數(shù)來看，隨著試驗(yàn)的推進(jìn)呈逐漸降低趨勢，這主要與胸腺本身會隨年齡增長逐漸退化，最后被脂肪代替相關(guān)。但在整個試驗(yàn)過程中，兩個試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)降低速度相比對照組緩慢，且隨著年齡增長差異顯著，說明預(yù)消化蛋白可以延緩胸腺的退化。機(jī)體的免疫能力與胸腺的生長周期密切相關(guān)，預(yù)消化蛋白延緩胸腺的退化，將對小鼠胸腺中T淋巴細(xì)胞分化成熟產(chǎn)生抗體起促進(jìn)作用。

由此可見，預(yù)消化蛋白對促進(jìn)免疫器官健康發(fā)育，提高機(jī)體體液免疫能力具有積極的作用。

3.4 預(yù)消化蛋白對腸黏膜免疫的影響

本試驗(yàn)過程中，小鼠各腸段腸黏膜SIgA呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，前3周逐漸上升，但在第4周的時候出現(xiàn)了全群下降，之后又恢復(fù)上升趨勢，說明小鼠的免疫能力隨著年齡的增長逐漸發(fā)展和完善，第4周的全群變化可能與氣候突變導(dǎo)致應(yīng)激所致。

試驗(yàn)結(jié)果表明，從第2周開始預(yù)消化蛋白顯著提高了小鼠十二指腸、空腸和回腸黏膜SIgA表達(dá)水平，且試驗(yàn)一組效果優(yōu)于試驗(yàn)二組。楊小軍[5]在“灌胃大豆蛋白、面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物對大鼠免疫功能的影響”中研究表明，灌喂兩種蛋白水解液能顯著提高腸腔SIgA水平，與本試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)一致。SIgA是腸道黏膜免疫的核心，本試驗(yàn)結(jié)果說明預(yù)消化蛋白對小鼠的腸黏膜免疫功能具有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

綜上所述，預(yù)消化蛋白對小鼠腸道的健康發(fā)育和免疫能力具有顯著的促進(jìn)和提高作用，且綜合各檢測指標(biāo)的檢驗(yàn)結(jié)果以2.5%的添加量為宜。