王子見 陳融

摘 要：脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型（spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）又稱馬查多-約瑟夫?。∕achado-Joseph disease，MJD），是由于編碼谷氨酰胺的密碼子CAG的異常擴(kuò)增而引起的1種常染色體顯性遺傳疾病。索拉菲尼是1種新型多靶向性的治療腫瘤FDA藥物，通過構(gòu)建SCA3細(xì)胞模型，利用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）等技術(shù)手段，探索索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型中突變蛋白ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，不同濃度的索拉菲尼藥物處理2h后，對SCA3細(xì)胞凋亡沒有抑制作用，也沒有毒性作用，但在濃度為1μM時(shí)，有抑制細(xì)胞凋亡的趨勢；在加藥24h后，對細(xì)胞凋亡沒有抑制作用，而且在濃度為100μM和1000μM時(shí)，對SCA3細(xì)胞模型具有毒性作用。此研究豐富了舊藥新作用，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)也提供了作用濃度和時(shí)間的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型；索拉菲尼；MTT法

中圖分類號(hào) R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）18-0015-03

The Effect of Sorafenib Tosylate on Apoptosis Induced by Pathogenic Protein Ataxin-3 in SCA3 Cell Model

Wang Zijian et al.

（College of Biological and Environmental Engineering，Xi'an University，Xi'an 710065，China）

Abstract：Spinal cerebellar ataxia type 3（SCA3），also known as Machado-Joseph disease（MJD），is an autosomal dominant genetic disease caused by abnormal amplification of codon CAG encoding glutamine. Sorafenib tosylate is an FDA drug to treat cancer by the various pathways. Based on the various targets of Sorafenib tosylate，this study proposes that whether it has an effect on SCA3 cells. The effect of sorafenib tosylate on apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 in SCA3 cell model was explored via MTT method and other methods. The results show thart. In this study，sorafenib tosylate did not inhibit the apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 and no toxic effect for 2 hours However，it showed the inhibited tendency at the concentration of 1μM after the treatment of 2 hours. It was also found that sorafenib tosylate showed toxic to cells at the concentration of 100μM and 1000μM after the treatment of 24 hours. This investigation offers new function of old drug and also provides a proof of concentration and treatment time of sorafenib tosylate for further studies.

Key words：Spinocerebellar ataxia type 3；Sorafenib tosylate；MTT method

隨著人口老齡化的加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐年遞增。遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)是常見的中樞神經(jīng)變性疾病，該病有諸多亞型，其中脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型（SCA3）是最常見的1種亞型，其致病機(jī)制是SCA3中CAG的異常擴(kuò)增序列導(dǎo)致編碼蛋白ataxin-3的羧基端出現(xiàn)，形成較長的多聚谷氨酰胺肽鏈[1]。該多聚谷氨酰胺肽鏈被認(rèn)為是細(xì)胞形成包涵體的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)，從而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，但CAG重復(fù)長度與脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)型小腦變性的發(fā)生率無關(guān)[2]。該病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，有小腦共濟(jì)性失調(diào)，眼珠運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀，因此基因?qū)W檢測是診斷該病的最佳手段。目前針對SCA3，臨床上大多為對癥治療或延緩病情，如采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療，在一定程度上能夠改善脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)患者的臨床癥狀，且較為安全[3]。也有學(xué)者提出針對人ATXN3的反義寡核苷酸可能具有良好的耐受性，進(jìn)行SCA3的預(yù)防性治療[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉對SCA3細(xì)胞模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。而丙戊酸鈉的不良反應(yīng)主要集中在10歲以下的兒童[6]，因此該藥針對兒童使用還需進(jìn)一步探討。針對神經(jīng)退行性疾病較多的病因，張文婷提出針對神經(jīng)退行性疾病的多靶點(diǎn)藥物，設(shè)計(jì)出的PARP-1抑制劑（1-7）[7]具備多功能神經(jīng)保護(hù)作用。

索拉菲尼是1種具有較好抗腫瘤作用的新型靶向藥物，是首個(gè)獲準(zhǔn)上市的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，該藥的優(yōu)點(diǎn)包括具備多靶點(diǎn)機(jī)制，耐受性好，易于聯(lián)合用藥，且患者的依從性也更好。神經(jīng)退行性疾病比如馬查多—約瑟夫病（Machado-Joseph disease，MJD）、阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）以及帕金森?。≒arkinson's disease，PD）等均是由多種病因引起，造成神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程也十分復(fù)雜。而只是以單個(gè)靶點(diǎn)為基礎(chǔ)而設(shè)計(jì)的藥物在治療這類疾病上并沒有達(dá)到令人滿意的效果?，F(xiàn)在，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病，隨著其致病因素和發(fā)病機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)，具備多靶點(diǎn)治療作用的藥物也納入研究中，這為治療神經(jīng)退行性疾病提供了新思路，也為其藥物研究開辟了1個(gè)嶄新的領(lǐng)域。目前，對于多靶點(diǎn)功能的索拉菲尼，還沒有在神經(jīng)退行性疾病上治療的相關(guān)研究。本研究主要討論不同時(shí)間及濃度的索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型的作用，以此為神經(jīng)退行性疾病的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293細(xì)胞由倫敦大學(xué)學(xué)院薛少安教授惠贈(zèng)。peGFP-ataxin-3-77CAG質(zhì)粒由德國圖賓根大學(xué)Thorsten Schimdt博士惠贈(zèng)。索拉菲尼購自Santa Cruz Biotechnology公司（Cat.No.475207-59-1）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和提取 取出感受態(tài)細(xì)胞DH5α（大腸桿菌）于冰上融化，加入質(zhì)粒，混勻，置于冰上30min；隨后42℃熱擊90s，迅速置冰上，加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基混勻，37℃恒溫?fù)u床（150rpm）搖45min。取出菌液，劃線涂板，37℃倒置過夜培養(yǎng)；選取菌落進(jìn)行挑菌，PCR鑒定。將PCR鑒定成功的菌落挑出，加入培養(yǎng)基，37℃搖床（150rpm）搖菌過夜。次日，取出菌液，離心（2000rpm，10min），棄去上清液，按照GIAGEN plasmid mini kit試劑盒說明書提取質(zhì)粒，使用Nanodrop2000檢測質(zhì)粒濃度。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與加藥 按照梭華sofast轉(zhuǎn)染試劑說明書，取2μg質(zhì)粒，3μL梭華sofast，100μL培養(yǎng)液，室溫靜置30min，加入到六孔板內(nèi)。24h后，轉(zhuǎn)移至96孔板，24h后加藥處理，DMSO為陰性對照組，只含細(xì)胞為未處理對照組，藥物時(shí)間分別為2h和24h。如圖1所示，濃度依次為“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”，“D”為DMSO陰性對照、“空”為未處理對照組。

1.2.3 MTT法檢測 取出96孔板，每孔加入10μL MTT，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，4h后取出，離心，小心吸去上層清液，再加入100μL的DMSO，放入恒溫培養(yǎng)震蕩器中孵育10min，保證甲臜能充分溶解，而后將96孔板放入在酶聯(lián)免疫檢測儀中，測定于490nm波長時(shí)各孔的紫外光吸收值（OD值），分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCA3細(xì)胞模型的構(gòu)建 將peGFP-ataxin-3-77CAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48h后，突變ataxin-3蛋白過度表達(dá)，收集裂解細(xì)胞，Western blot檢測目的條帶。結(jié)果顯示，ataxin-3蛋白過表達(dá)，SCA3細(xì)胞模型構(gòu)建成功。1H9抗體檢測ataxin-3蛋白，大小為75kD的目的蛋白條帶，β-actin抗體檢測為42kD的actin內(nèi)參蛋白條帶。條帶1，2和3為3個(gè)蛋白樣品。

2.2 索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型處理2h的影響 SCA3細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，將細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，2h后，加入MTT，后加入DMSO溶解細(xì)胞形成中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處檢測吸光值（OD值）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，索拉菲尼在對SCA3細(xì)胞模型處理2h后，不同濃度的藥物處理組和DMSO陰性對照組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型中對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡沒有作用，同時(shí)，該藥物在不同濃度范圍內(nèi)均對SCA3細(xì)胞模型沒有毒性。此外，在藥物濃度為1μM時(shí)，與DMSO對照組相比，雖然沒有顯著性，但OD值相對值有增高的趨勢，這表明在該濃度時(shí)，藥物可能有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

以不同濃度藥物處理組和DMSO陰性對照組，分別與空白組的光吸收值的比值為縱坐標(biāo)，以不同處理組為橫坐標(biāo)，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔為5個(gè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2.3 索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型處理24h的影響 以上實(shí)驗(yàn)表明，2h的作用時(shí)間效果可能不明顯，因此下一步將SCA3細(xì)胞模型進(jìn)行藥物處理24h，加入MTT，后加入DMSO溶解細(xì)胞形成中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處檢測吸光值。結(jié)果顯示，索拉菲尼在對SCA3細(xì)胞模型處理24h后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡沒有作用，但是，在藥物濃度為100μM和1000μM時(shí)，與DMSO對照組相比，具有顯著差異，這表明這2個(gè)藥物濃度對SCA3細(xì)胞模型有毒性作用。

以相對OD值（不同濃度藥物處理組和DMSO陰性對照組，分別與空白組的光吸收值的比值）為縱坐標(biāo)，以不同的處理組為橫坐標(biāo)，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔為5個(gè)，進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析。**P<0.01。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，索拉菲尼處理2h后的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并沒有顯著差異，說明此藥對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡沒有作用，對SCA3細(xì)胞模型也沒有毒性作用，但從圖3可以看出在藥物濃度為1μM時(shí)，有抑制突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的趨勢，可作為后來研究者的參考濃度。而在索拉菲尼處理24h后，濃度為100μM和1000μM時(shí)，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，和DMSO對照組比對，具有顯著差異，這說明在24h的藥物處理中，這2個(gè)藥物濃度對SCA3細(xì)胞模型具有顯著毒性作用。因此，在后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)盡量避免使用這2個(gè)濃度。而在其它濃度中均無顯著差異，說明索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型沒有毒性作用，因此可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考濃度。綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中，2h時(shí)的藥物處理后，在單一濃度1μM時(shí)，索拉菲尼有抑制突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的趨勢；而在加藥處理24h，索拉菲尼毒性加大，不僅沒有抑制細(xì)胞凋亡的作用，在濃度為100μM和1000μM，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)參考，以及今后研究中，可進(jìn)一步優(yōu)化藥物作用時(shí)間，在2h和24h之間取不同時(shí)間繼續(xù)探討索拉菲尼的作用效果。

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型（SCA3）是1種遺傳性的神經(jīng)退行性疾病，該病致病機(jī)制復(fù)雜，主要是因?yàn)榫幋a谷氨酰胺的密碼子CAG的數(shù)量在ATXN3基因中的異常擴(kuò)增，形成突變的ataxin-3蛋白并匯聚形成包涵體，進(jìn)而會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。這個(gè)過程已知發(fā)生在患者易感腦區(qū)的神經(jīng)元胞核內(nèi)，但是該過程中的包涵體聚集和致病機(jī)制至今不明，也沒有有效的治療藥物，給患者和患者家屬造成了嚴(yán)重的身體、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。索拉菲尼是1種新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，具有雙重的抗腫瘤作用：一方面通過抑制由RAF/MEK/ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路而直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，另一方面通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子（PDGF）受體而阻斷腫瘤血管的形成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。為了尋找有效藥物來預(yù)防及治療該疾病，根據(jù)索拉菲尼多功能靶點(diǎn)功效，本研究通過構(gòu)建脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型（SCA3）細(xì)胞模型，以發(fā)病的病理現(xiàn)象（致病蛋白ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡）作為出發(fā)點(diǎn)，利用MTT，Western blot等技術(shù)手段，探索索拉菲尼對SCA3細(xì)胞模型中致病蛋白ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的影響，驗(yàn)證索拉菲尼是否對SCA3細(xì)胞模型具有保護(hù)作用，從而為該病的治療提供1種新的思路。

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（責(zé)編：王慧晴）