張久旭，劉洋，顧文宏，李夢(mèng)薇，何軍，趙保勝*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488； 2.云南天佑科技開(kāi)發(fā)有限公司，云南 芒市 678400)

辣木葉為辣木科辣木屬植物辣木(MoringaoleiferaLam)的干燥葉子，全世界約有14個(gè)辣木品種[1]。辣木葉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥效成分，在印度已有上千年的食用歷史，其提取物被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品中[2-4]。研究表明辣木葉具有降血糖、降脂、降壓、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、利尿、驅(qū)蟲(chóng)等作用[5-9]。

失眠，中醫(yī)稱為 “不寐”，主要是由氣血陰陽(yáng)失和或其他病證影響所致。而辣木改善睡眠作用的功效國(guó)外早已發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)行了相關(guān)的研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辣木根的水提物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，在一定的劑量下可以降低大鼠的自發(fā)性活動(dòng)[10]，辣木根的甲醇提取物也可以明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠時(shí)間[11-12]。

目前，改善睡眠的中藥復(fù)方以酸棗仁、五味子、茯苓、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志、甘草、丹參等藥物使用為主，其中安神類保健食品的主要成分為酸棗仁提取物和五味子提取物[13-15]。實(shí)驗(yàn)所采用的辣木葉復(fù)方由辣木葉與酸棗仁、五味子、遠(yuǎn)志、丹參組成。本文通過(guò)戊巴比妥鈉小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)，觀察辣木葉和辣木葉復(fù)方對(duì)小鼠睡眠功能的影響，并觀察不同配伍比例的辣木葉復(fù)方改善睡眠的作用。辣木葉的作用廣泛，但多用于功能食品，對(duì)于藥效學(xué)研究相對(duì)較少。本研究有望證明其對(duì)亞健康的確切療效，為辣木葉及其復(fù)方成藥性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HH-2恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市晨陽(yáng)電子儀器廠)；DZF真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200超聲波清洗儀器(300 w，40 kHz，寧波新芝生物科技股份有限公司)；島津高效液相色譜儀(LC-16，日本島津公司)；CPA225D電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 試劑與藥材

辣木葉(由合作企業(yè)云南天佑科技開(kāi)發(fā)有限公司提供)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為辣木科植物辣木MoringaoleiferaLam的干燥葉；酸棗仁(批號(hào)：1503009)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubeMill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子；五味子(批號(hào)：1702047)，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill. 的干燥成熟果實(shí)；遠(yuǎn)志(批號(hào)：17020448)，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalasibiricaL.的根；丹參(批號(hào)：1701027)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根；以上四種飲片均由北京太洋樹(shù)康中藥飲片廠提供。戊巴比妥鈉(分析純，批號(hào)：20170611)購(gòu)買(mǎi)于上海伊卡生物技術(shù)有限公司；巴比妥鈉(分析純，批號(hào)：570471)購(gòu)買(mǎi)于北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司，批號(hào)：164790)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號(hào)：20170209)；磷酸(分析純，北京化工廠，批號(hào)：20160111)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：201102GQ07547)；異槲皮苷(純度92.9%，111809-201403)購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；紫云英苷(純度99.5%，批號(hào)：Y27J7H9634)購(gòu)買(mǎi)于上海源葉生物科技有限公司；丹酚酸B(純度99.5%,批號(hào)：ST00050120MG)購(gòu)買(mǎi)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)ICR小鼠180只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由北京斯貝福生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水和進(jìn)食。

將ICR小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組90只，雌雄各半。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組又按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組、辣木葉低劑量(1.3 g/kg)組、辣木葉中劑量(2 g/kg)組、辣木葉高劑量(2.6 g/kg)組，酸丹五遠(yuǎn)組(1.2 g/kg)，復(fù)方組合①(辣木葉1.3 g/kg+酸丹五遠(yuǎn)1.2 g/kg)組、復(fù)方組合②(辣木葉2 g/kg+酸丹五遠(yuǎn)1.2 g/kg)組、復(fù)方組合③(辣木葉2.6 g/kg+酸丹五遠(yuǎn)1.2 g/kg)組，共8組，每組10只。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取異槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B10.23 mg于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，做儲(chǔ)備液。精密吸取異槲皮苷儲(chǔ)備液1.74 mL，紫云英苷儲(chǔ)備液0.94 mL，丹酚酸B儲(chǔ)備液0.96 mL于5 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，做混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

分別取辣木葉中劑量組提取物、酸丹五遠(yuǎn)提取物、不用配伍比例辣木葉復(fù)方提取物各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇溶液，稱重。超聲30 min后取出，冷卻至室溫，再次稱重，加入純甲醇補(bǔ)足缺失的重量。用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為B(乙腈)-A(0.1%磷酸水)，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min 20%B，16 min 20%B，26 min 40%B，29 min 40%B，30 min 20%B，36 min 20%B，流速為1.3 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 受試藥物的制備

辣木葉提取物的制備：稱取辣木葉97.93 g于2 000 mL圓底燒瓶，加入100 mL蒸餾水，浸泡2 h。回流提取2 h，保持微沸狀態(tài)，用紗布過(guò)濾，收集初濾液，再加入1 000 mL蒸餾水，回流提取2 h，合并兩次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉提取物。

辣木葉復(fù)方提取物的制備：以2倍處方量稱取各藥材(辣木葉、酸棗仁、丹參、遠(yuǎn)志、五味子)按不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行加熱回流提取，放冷后過(guò)濾，靜置過(guò)夜，去除沉淀得澄清液體，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉復(fù)方提取物。

去辣木葉復(fù)方提取物的制備：以2倍處方量稱取各藥材(酸棗仁、丹參、遠(yuǎn)志、五味子)，按不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行加熱回流提取，放冷后過(guò)濾，靜置過(guò)夜，去除沉淀得澄清液體，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到去辣木葉復(fù)方提取物。

2.5 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

每天上午8-10點(diǎn)按體質(zhì)量灌胃給藥，模型對(duì)照組給予等積體的蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥2周。于最后一次給藥后30 min，各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失30 s以上作為進(jìn)入睡眠的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以翻正反射再現(xiàn)為睡眠結(jié)束，觀察記錄注射戊巴比妥鈉后各組小鼠的睡眠時(shí)間(翻正反射消失至翻正反射再現(xiàn)的時(shí)間)，進(jìn)行組間比較。

2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

每天上午8-10點(diǎn)按體質(zhì)量灌胃給藥，模型對(duì)照組給予等積體的蒸餾水，連續(xù)給藥2周。于末次給藥后30 min，各組小鼠按250 mg/kg腹腔注射巴比妥鈉，以翻正反射消失30 s以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，以翻正反射再現(xiàn)為睡眠結(jié)束，觀察記錄注射催眠劑量巴比妥鈉后各組小鼠的睡眠潛伏期(注射巴比妥鈉至翻正反射消失的時(shí)間)，進(jìn)行組間比較。

2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn)

在“2.3”色譜條件下測(cè)得空白輔料、對(duì)照品和辣木葉、去辣木葉組、及辣木葉復(fù)方譜圖見(jiàn)圖1，各樣品含量見(jiàn)表2，對(duì)照品異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B，保留時(shí)間分別為9.985、14.872、24.973 min，表明該體系中輔料和其它成分均不干擾待測(cè)物的測(cè)定。從高效液相色譜法含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，按日服用生藥量計(jì)算，三個(gè)復(fù)方組合中異槲皮苷和紫云英苷較單味藥辣木葉的含量有所下降，只有復(fù)方組合③的異槲皮苷含量明顯增高，但是丹酚酸B的含量在三個(gè)復(fù)方中都有所增高，以復(fù)方組合②最為顯著。

圖1 HPLC色譜圖

樣品異槲皮苷含量(mg·g-1)紫云英苷含量(mg·g-1)丹酚酸B含量(mg·g-1)辣木葉低劑量31.82915.549—辣木葉中劑量48.96823.921—辣木葉高劑量63.65931.097—酸丹五遠(yuǎn)——14.74復(fù)方組合①22.81710.41918.304復(fù)方組合②42.77620.97463.499復(fù)方組合③88.71318.13927.387

3.2 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

腹腔注射戊巴比妥鈉后，模型組小鼠均出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。給藥2周后，與模型組比較，辣木葉復(fù)方組合①和②均明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間(P<0.05或P<0.01)；而辣木葉低劑量、中劑量、高劑量組以及酸丹五遠(yuǎn)組及復(fù)方組合③組與模型組比較，小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間有延長(zhǎng)趨勢(shì)，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 辣木葉及其復(fù)方對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

腹腔注射巴比妥鈉后，模型組小鼠均出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。各給藥組與模型組比較，小鼠的睡眠潛伏期均明顯縮 短，差異具有顯著性(P<0.001)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對(duì)巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

注：與模型組比較,**P<0.01

4 討論

辣木葉是藥食同源的植物，在國(guó)外具有悠久的藥用歷史，廣泛用于羅馬人、希臘人和以及烏納尼人和錫達(dá)人的醫(yī)療系統(tǒng)，我國(guó)于20世紀(jì)60年代引入辣木，目前在云南和廣東等地有所種植[16-18]。國(guó)內(nèi)對(duì)辣木葉的藥用價(jià)值研究相對(duì)較少，目前大部分的研究認(rèn)為與其藥效作用相關(guān)的化學(xué)成分主要是辣木葉中的黃酮類和多酚類，但其確切的有效成分和作用機(jī)制還尚不清楚[19]。本實(shí)驗(yàn)選取辣木葉中含量較高的成分異槲皮苷和紫云英苷做為指標(biāo)性成分，其中異槲皮苷具有一定的抗氧化、抗腫瘤和抗血小板凝集作用，從而具有一定的大腦保護(hù)作用[20]，紫云英苷則具有抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗肝毒、抗心律失常、擴(kuò)張血管、保護(hù)心肌的作用[21]，這些作用可能與其改善睡眠的機(jī)制有關(guān)。而丹酚酸B是丹參提取物中的主要水溶性成分之一，研究表明丹酚酸B具有多種藥理作用，能夠改善心肌缺血，同時(shí)對(duì)心肌梗死具有很好的保護(hù)作用[22]，在治療心脾兩虛型的失眠癥中有很好的療效[23]。

在三個(gè)不同配伍比例的辣木葉復(fù)方中，藥理作用顯著的復(fù)方②在三個(gè)化合物的含量上，紫云英苷和丹酚酸B的含量較高，而異槲皮苷含量適中，可見(jiàn)中藥復(fù)方的藥效并不是與化合物含量呈絕對(duì)正相關(guān)，與其配伍比例有著重量的聯(lián)系。方藥配伍比例的變化嚴(yán)重影響了其功效，同樣的配伍在使用不同的配伍劑量后，可能會(huì)產(chǎn)生不用的藥理效應(yīng)，甚至改變方藥的藥效，故而有“漢方不傳之秘在量上”之說(shuō)[24]。因此配伍比例的研究也是探討配伍規(guī)律的一個(gè)重要方面。

在延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，辣木葉組和酸丹五遠(yuǎn)組與模型組相比沒(méi)有顯著性差異，但是出現(xiàn)了延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的趨勢(shì)，說(shuō)明其具有一定的改善睡眠功效。辣木葉復(fù)方組則出現(xiàn)了明顯的延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的作用，尤其是辣木葉復(fù)方②的作用更為明顯，說(shuō)明辣木葉與酸丹五遠(yuǎn)可能存在協(xié)同作用。

在巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組與模型組比較均有顯著性差異，且辣木葉復(fù)方②更為明顯。從以上研究中分析，辣木葉復(fù)方具有改善睡眠功能的作用，其中以辣木葉復(fù)方組合②(辣木葉2 g/d+酸丹五遠(yuǎn)1.2 g/d)的作用更為明顯。以上研究對(duì)于探討辣木葉復(fù)方改善睡眠作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定參考意義，為辣木葉改善睡眠復(fù)方的進(jìn)一步深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

隨著時(shí)代的發(fā)展，生活壓力的增大，越來(lái)越多的人患有失眠癥。針對(duì)失眠癥的綜合治療方法中，中藥具有我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特色與優(yōu)勢(shì)，安全性高、療效較好，特別是中藥類保健食品與藥膳的可接受性強(qiáng)、無(wú)毒副作用，長(zhǎng)期使用對(duì)失眠癥確有一定療效。實(shí)驗(yàn)證明，辣木葉復(fù)方對(duì)睡眠有一定的改善作用，但其改善睡眠作用的藥理機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。