都芳濤，方繼峰，李興晶，喬培柳，李廣義

(山東泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城市第二人民醫(yī)院骨外科，山東 臨清 252600)

脊髓損傷可導(dǎo)致四肢及軀體受損部位功能障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，包括骨髓水腫與受損部位的細(xì)胞凋亡，甚至終生殘疾及死亡[1]，這種損傷包括急性損傷與二次損傷。急性脊髓損傷可導(dǎo)致脊髓部分或全部破裂[2-3]。原發(fā)性脊髓損傷可降解關(guān)鍵的細(xì)胞骨架及活性功能蛋白，導(dǎo)致病變部位及其周圍神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的遲發(fā)性死亡[4-5]。原發(fā)性損傷是機(jī)械損傷，是不可避免的[6]，而二次損傷可通過干預(yù)進(jìn)行避免[7]。大量研究都致力于了解脊髓二次損傷的機(jī)理，以達(dá)到開發(fā)出可以改善甚至是逆轉(zhuǎn)脊髓損傷的治療方法。川芎嗪是中藥川芎中的生物堿，有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以減輕腦損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。另外，川芎嗪可以抑制淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤及促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)，降低炎癥相關(guān)的信號(hào)分子和細(xì)胞核因子κB的活性，促進(jìn)缺血神經(jīng)元和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)核因子E2 、相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。然而，川芎嗪針對(duì)脊髓損傷的作用機(jī)理大部分處于未知狀態(tài)。本研究主要是通過對(duì)照研究川芎嗪對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪可能通過提高Nrf2-GCLc/GCLm信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷的康復(fù)，從而改善氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月—2018年5月在我院治療的90例脊髓損傷患者，46名男性和44名女性；年齡45～67歲，平均(55.56±9.54)歲。分為對(duì)照組、高劑量川芎嗪組和低劑量川芎嗪組，平均每組30人，兩組間性別、年齡無差異(P>0.05)。見表1。

表1 患者一般情況比較

1.2 分組與給藥

對(duì)照組患者在治療過程中靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)靜滴14 d。高劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+240 mg川芎嗪，連續(xù)靜滴14 d。低劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+120 mg川芎嗪，連續(xù)靜滴14 d。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

患者靜脈滴注療程結(jié)束后進(jìn)行腰椎穿刺抽取腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)廠家說明書(天根生化科技北京有限公司)，采用Trizol法提取總RNA。并對(duì)cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而后采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行樣品分析(BIORAD CFX96實(shí)時(shí)平臺(tái)，SYBR Premix Ex TaqTM II)?；虻谋磉_(dá)歸一化到β-肌動(dòng)蛋白水平，并采用2-△△Ct進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 促炎性細(xì)胞因子的生化檢測(cè)

抽取患者腦脊液后根據(jù)廠家的說明書，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定其中的IL-1β、TNF-α、Nrf2及GCLc與GCLm的含量(BioVision公司)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對(duì)炎癥反應(yīng)的作用

炎癥反應(yīng)與脊髓損傷的病情發(fā)展密切相關(guān)，研究顯示抗炎作用能改善脊髓損傷[10-12]。本次研究中，我們?cè)u(píng)估了川芎嗪對(duì)脊髓損傷患者體內(nèi)炎癥的作用。如表2所示，與對(duì)照組患者相比，給予川芎嗪靜滴的脊髓損傷患者的腦脊液中的TNF-α與IL-1β的mRNA表達(dá)明顯降低。

表2 川芎嗪對(duì)TNF-α和IL-1β含量的影響

2.2 川芎嗪對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)主要調(diào)節(jié)因子的作用

脊髓損傷患者體內(nèi)Nrf2(一種重要的氧化還原控制因子)的mRNA表達(dá)顯著降低。攝入川芎嗪可以顯著抑制脊髓損傷患者體內(nèi)Nrf2的表達(dá)降低。另外，GCLc與GCLm的mRNA表達(dá)在挫傷性脊髓損傷后顯著下調(diào)。川芎嗪可以顯著上調(diào)GCLc與GCLm的mRNA表達(dá)。見表3。

表3 川芎嗪對(duì)Nrf2、GCLc、GCLm含量的影響

3 討論

川芎嗪主要成分為2，3，5，6-四甲基吡嗪，是從川芎根莖中提取分離的生物堿單體，有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦損傷的作用[10]，該物質(zhì)可能存在保護(hù)神經(jīng)及促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用，但目前關(guān)于川芎嗪對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)元再生的作用機(jī)理的研究較少。此次研究中，我們抽取脊髓損傷患者腦脊液進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定和促炎性細(xì)胞因子的生化檢測(cè)，以此評(píng)估川芎嗪對(duì)脊髓損傷恢復(fù)作用過程中抗氧化及抗炎癥活性的作用。

炎癥反應(yīng)與脊髓損傷的病情發(fā)展密切相關(guān)，降低炎癥反應(yīng)可以改善脊髓損傷，促進(jìn)脊髓的恢復(fù)[11-12]。有研究表明，脊髓損傷后IL-1β含量上升是慢性損傷的重要信號(hào)[13]。脊髓損傷的炎癥反應(yīng)與TNF-α相關(guān)聯(lián)，其表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可抑制脊髓損傷過程中炎性反應(yīng)，主要通過IL-1β與TNF-α的表達(dá)反映出來。先前研究表明川芎嗪可以抑制大鼠急性損傷后脊髓組織中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、NF-Kβ及IL-1β的表達(dá)，阻止白細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)NF-Kβ抑制蛋白和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，達(dá)到減輕急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的目的[11]。川芎嗪還能抑制脊髓損傷小鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和中性粒細(xì)胞浸潤，延遲脊髓繼發(fā)性損傷和保護(hù)脊髓[9]。川芎嗪無論劑量大小均可降低腦缺血組織中EDI、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)腦組織[16]。結(jié)合以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，川芎嗪的抗炎作用可能與脊髓損傷的恢復(fù)有關(guān)。在本研究中，通過利用在治療脊髓損傷患者過程中靜滴川芎嗪探討患者腦脊液中炎性因子的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者在給予靜滴川芎嗪后TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯下降，川芎嗪對(duì)于減輕脊髓損傷具有重要作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)可以影響脊髓損傷的發(fā)病及發(fā)展[17]。川芎嗪通過抗氧化、抗凋亡等途徑對(duì)腦組織進(jìn)行保護(hù)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[18]，川芎嗪可通過提高核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和谷氨酰半胱氨酸鏈接酶(GCLc)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，降低ROS水平，阻斷細(xì)胞凋亡，恢復(fù)線粒體功能，改善氯化鈷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腦神經(jīng)損傷，達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)的作用。川芎嗪還可提高Nrf2和GCLc的表達(dá)抑制MPTP誘導(dǎo)的大鼠大腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激損傷[19]。與既往研究不同，此次研究通過針對(duì)脊髓損傷患者治療過程中靜滴川芎嗪，抽取腦脊液測(cè)定相關(guān)因子的PCR表達(dá)，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)因子，例如Nrf2、GCLc、GCLm的mRNA表達(dá)明顯增加，大劑量應(yīng)用川芎嗪的脊髓損傷患者增加更為明顯，成正相關(guān)性，這說明川芎嗪對(duì)于脊髓損傷患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)有重要作用，這對(duì)于以后在臨床上應(yīng)用川芎嗪治療脊髓損傷患者提供了新的方向。

另外，臨床藥理實(shí)驗(yàn)證明，川芎嗪具有抗血小板聚集作用，可改善微循環(huán)，抗氧化、抗纖維化和拮抗Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[20-23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，川芎嗪可降低缺血再灌注后大腦皮質(zhì)腫瘤壞死因子-α含量和髓過氧化物酶活性，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腦缺血大鼠的腦神經(jīng)[24]。此次研究我們進(jìn)一步驗(yàn)證：川芎嗪可改善氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，降低脊髓損傷，促進(jìn)脊髓損傷患者的恢復(fù)，這些結(jié)果為川芎嗪治療相關(guān)的脊髓損傷與神經(jīng)退行性疾病提供了新的視角。