李春蕾

（山東省煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，煙臺(tái) 264003）

0 引言

大腸桿菌是人畜腸道內(nèi)一種常見(jiàn)的菌株，1988年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大腸桿菌時(shí)，認(rèn)為其為非致病性菌株。20世紀(jì)中期，部分學(xué)者認(rèn)識(shí)到一些血清型特殊的大腸埃希菌具有致病性，特別對(duì)嬰幼兒和幼畜危害巨大。致病性大腸桿菌是引起多種疾病的萬(wàn)惡之首，常使人畜出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，如仔豬紅白痢等。同時(shí)，引起仔豬水腫病、敗血癥以及影響畜禽生長(zhǎng)發(fā)育等，造成畜禽的生產(chǎn)能力低下，嚴(yán)重者甚至造成大量的死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。致病性大腸埃希菌具有廣泛的傳播性，其通過(guò)食物、水源以及空氣等經(jīng)質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移等方式進(jìn)行傳播，進(jìn)而引發(fā)疫情，給畜牧業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅[1]。大量研究表明，致病菌的致病機(jī)理與毒力基因有關(guān)[2]。不同來(lái)源和不同基因背景的菌株的毒力基因分布存在顯著的差異[3]。研究以山東地區(qū)送檢病料分離的致病性大腸桿菌為例，分析山東地區(qū)分離的致病性大腸桿菌攜帶毒力基因情況，探究毒力基因分布差異情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株。試驗(yàn)菌株來(lái)源于2013—2015年從山東省不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集患病豬內(nèi)臟。ATCC25922藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)株由實(shí)驗(yàn)室保存。

（2）培養(yǎng)基及試劑。麥康凱培養(yǎng)基（購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司），PCRbuffer、dNTP和TaqDNA聚合酶均購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；DL5 000 DNA Marker購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌分離鑒定

將山東省不同地區(qū)送檢病料樣品于麥康凱培養(yǎng)基劃線(xiàn)培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)玫紅色可疑菌落，接種于非選擇性MHA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落采用水煮法提取DNA，進(jìn)行16sPCR擴(kuò)增，然后測(cè)序。通過(guò)pubmed-blast比對(duì)，將鑒定為陽(yáng)性的大腸桿菌保存于30%的甘油肉湯中，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大腸桿菌DNA提取

將分離鑒定的大腸桿菌接種影響瓊脂，37 ℃培養(yǎng)14 h，挑取單一菌落加入到100μL滅菌雙蒸水中，100 ℃煮沸10 min，冰浴10 min，離心機(jī)12 000 rpm離心2 min，取上清，備用。

1.2.3 毒力基因檢測(cè)

宋彬[4]等試驗(yàn)研究中設(shè)計(jì)合成的引物（見(jiàn)表1），由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。

表1 大腸桿菌毒力基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定

山東地區(qū)送檢樣品經(jīng)培養(yǎng)基篩選，16SrRNA PCR凝膠電泳和測(cè)序鑒定見(jiàn)圖1，最終確定共獲得大腸桿菌205株。

圖1 16SrRNA凝膠電泳圖

2.2 大腸桿菌毒力基因檢測(cè)

通過(guò)PCR檢測(cè)擴(kuò)增毒力基因攜帶情況 ，發(fā)現(xiàn)sitA攜帶率最高，達(dá)66.82%；其次是fimC ，攜帶率高達(dá)65.85%；而eaeA攜帶率最低為0.98%。多個(gè)毒力基因的檢測(cè)表明，山東地區(qū)送檢病料分離大腸桿菌攜帶毒力基因陽(yáng)性率高，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

圖2 fimC毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 sitA毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 部分hlyF、iss、papC、iucD、irp2毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

大腸桿菌致病性的主要原因是產(chǎn)生各種毒力因子，不同大腸桿菌的致病性的產(chǎn)生主要與其攜帶的不同的毒力基因有關(guān)，研究從送檢病料分離的菌株共205株，共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)8個(gè)毒力基因，其中各種毒力基因的攜帶情況各不統(tǒng)一，其中攜帶毒力基因最多的為sitA和fimC，而其中fimC是高致病力菌株的標(biāo)致基因，大量毒力基因攜帶和傳播是致病性大腸桿菌防控的主要難點(diǎn)[5]。有不同的研究人員通過(guò)探究大腸桿菌的毒力基因以及血清型分析大腸桿菌的致病性，不少專(zhuān)家認(rèn)為質(zhì)粒具有傳遞性，當(dāng)致病性大腸桿菌的質(zhì)粒上攜帶大量毒力基因時(shí)，增加了傳遞的風(fēng)險(xiǎn)和危害，同時(shí)給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)[6]。大量不同的研究方法發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌攜帶大量毒力基因影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展[7]。

4 結(jié)束語(yǔ)

研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)送檢病料分離的大腸桿菌中攜帶大量毒力基因，應(yīng)引起畜牧養(yǎng)殖戶(hù)的高度重視。