張?jiān)粕?，楊宇澤，郭占寶，謝 明，常 卓，張智英，侯水生*

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；3．北京市畜牧總站，北京 100101)

北京鴨具有生長(zhǎng)速度快和育肥快的特點(diǎn)，因此北京烤鴨也是馳名中外的佳肴。但是隨著人們對(duì)健康食品需求的增加，低皮脂率的北京鴨越來越受到大眾的歡迎，因此選擇胴體脂肪含量適宜的北京鴨品種就非常必要。鴨皮脂率的高低與鴨胸肉中的脂肪含量呈正相關(guān)，鴨肉中過低的脂肪含量會(huì)影響鴨肉的風(fēng)味和口感，而較高的脂肪含量會(huì)改善肉的風(fēng)味和品質(zhì)，因此需要對(duì)北京鴨的脂肪含量進(jìn)行不同方向的選擇，以滿足人們對(duì)不同風(fēng)味鴨肉的需求。鴨肉脂肪含量的高低取決于日糧組成、血漿激素水平等因素[1-4]。瘦肉型和肉脂型品種間的差異主要由代謝過程驅(qū)動(dòng)[5-6]。瘦肉型和肉脂型鴨保存能量的方式也有很大的差異，瘦肉型主要通過增加蛋白質(zhì)的沉積保存能量，而肉脂型則優(yōu)先使用飼料能量來進(jìn)行脂肪組織的合成[7]。

Koch等[8]首次提出以剩余采食量(residual feed intake, RFI)作為評(píng)價(jià)動(dòng)物個(gè)體飼料轉(zhuǎn)化效率的指標(biāo)。研究表明，與高RFI豬相比，低RFI豬的胴體水分和脂肪含量較低，但是蛋白含量略高[9-10]；豬腰部更大、背膘更薄，瘦肉率更高[11-15]。Begli等[16]研究表明，RFI性狀的育種值與雞F2群體的體重腹脂率等顯著相關(guān)，與胸肌率呈負(fù)相關(guān)。Zhang等[17]研究表明，RFI與北京鴨的皮脂率呈顯著正相關(guān)。因此，本研究對(duì)北京鴨的RFI性狀進(jìn)行了連續(xù)3個(gè)世代的選擇，形成了兩個(gè)胴體脂肪含量差異顯著的北京鴨品系。為了更清楚的了解不同RFI品系北京鴨脂肪沉積能力差異的原因，本試驗(yàn)采用了iTRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)分析了不同RFI品系的北京鴨皮脂蛋白質(zhì)組分，為進(jìn)一步研究北京鴨脂肪的沉積機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用不同品系北京鴨由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所種鴨場(chǎng)提供。高、低RFI品系各100只雄性雛鴨，同條件下飼養(yǎng)6周，然后各品系隨機(jī)選取12只取皮脂，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：iTRAQ?Reagent-8Plex Multiplex Kit(Applied Biosystem)；strata-X C18 除鹽柱(phenomenex)；SCX強(qiáng)陽離子交換柱(phenomenex Luna SCX 100A)；R6834RNA試劑盒(Omega美國(guó))；Thermo First cDNA合成試劑盒(SinoGene中國(guó))

1.2 方法

1.2.1 不同RFI品系北京鴨皮脂蛋白提取消化 將皮脂樣品在液氮中磨成粉，然后加入4倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀2 h，20 000 g離心30 min，收集沉淀，重復(fù)2次上述操作；然后加入TEAB溶解蛋白。采用Bradford方法定量總蛋白。高RFI組和低RFI組分別等量混合12只個(gè)體的皮脂蛋白。

1.2.2 不同RFI品系北京鴨皮脂蛋白iTRAQ標(biāo)記及肽段分離 提取的總蛋白進(jìn)行酶切除鹽。根據(jù)iTRAQ試劑操作手冊(cè)步驟進(jìn)行操作。兩份樣品分別用113和114 iTRAQ試劑標(biāo)記。

1.2.3 不同RFI品系北京鴨皮脂部分差異蛋白編碼基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析 使用總RNA提取試劑盒從皮脂中制備總RNA，然后根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說明書利用Thermo First cDNA合成試劑盒(SinoGene，中國(guó))進(jìn)行cDNA合成。使用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems StepOnePLUS)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

選取部分差異蛋白的編碼基因，分析其mRNA在鴨高、低RFI品系皮脂中的表達(dá)量。應(yīng)用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物序列(表1)。用β-actin基因?qū)悠愤M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后使用2-ΔΔCt方法計(jì)算倍數(shù)變化，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

表1差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物序列

Table1Theprimersequenceforreal-timePCRofthedifferentiallyexpressedgenes

簡(jiǎn)寫Abbreviation基因名稱Gene nameNCBI登錄號(hào)NCBI accession No.引物序列(5′→3′)Primer sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProduct sizeFASNfatty acidgi| 630056824F:GTGCCAGCAAAGCTTTCGATGC142synthaseR:GGAGTAACACTGATGGCTTTAAFABP1basic fatty acidgi| 878278835F:AGTGGAACCTGGCAGGTCTAT111binding proteinR:GATATTAAGCCTGTTGTTGAAPLINperilipingi| 878278714F:AAGCCGAGCGCACCCCAGGCAC120R:GCAGGAGAAAGCAGGGAAGAAG

1.3 質(zhì)譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

將樣品應(yīng)用LC-MS-MS進(jìn)行檢測(cè)，然后用ProteinPilot軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對(duì)蛋白質(zhì)組iTRAQ定量，差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍視為顯著差異表達(dá)蛋白。運(yùn)用GO富集分析對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，選擇GO(Gene Ontology)的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能注釋對(duì)蛋白進(jìn)行分類。利用SING在線軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析。

2 結(jié) 果

2.1 高、低RFI品系北京鴨皮脂差異表達(dá)蛋白及GO分析

在北京鴨皮脂中鑒定到了859個(gè)蛋白，選擇表達(dá)量差異1.5倍以上的作為顯著差異標(biāo)準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)59個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中在低RFI品系中高表達(dá)的蛋白34個(gè)，在高RFI品系中高表達(dá)蛋白25個(gè)(表2)。

對(duì)皮脂中差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明，在細(xì)胞組分本體中，差異表達(dá)蛋白主要分布于中間絲狀體、細(xì)胞骨架、包圍區(qū)域、細(xì)胞連接以及線粒體(圖1 A)；在生物學(xué)過程本體中，差異蛋白主要包括組織發(fā)育、有機(jī)酸代謝、脂類應(yīng)答、脂類合成、角質(zhì)化、上皮細(xì)胞分化等生物學(xué)過程(圖1B)；在分子功能本體中，差異表達(dá)蛋白主要參與離子結(jié)合、氧化還原、細(xì)胞骨架構(gòu)成、裂解酶活性等生物學(xué)功能(圖1 C)。

2.2 高、低RFI品系北京鴨皮脂差異表達(dá)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

大部分的單個(gè)蛋白質(zhì)只是作為活性細(xì)胞中較大蛋白質(zhì)復(fù)合物的基本組成部分，蛋白質(zhì)之間需要相互協(xié)作才能發(fā)揮出相應(yīng)的生物學(xué)功能。因此，這些差異豐度蛋白很可能就是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中具有各種關(guān)系的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，本研究應(yīng)用STRING 10.5在線工具分析了差異表達(dá)蛋白之間的相互作用，不同RFI品系鴨皮脂差異表達(dá)蛋白之間的互作分析見圖2。差異表達(dá)蛋白主要參與脂肪代謝、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、粘連錨定以及離子、維生素結(jié)合等功能。

2.3 高、低RFI品系北京鴨部分皮脂差異表達(dá)蛋白編碼基因qRT-PCR分析

利用qRT-PCR方法測(cè)定6周齡高低RFI北京鴨品系皮脂中脂肪酸合酶(FASN)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP1)、圍脂滴蛋白(PLIN)mRNA表達(dá)水平(圖3)。由圖3可以看出，高RFI品系北京鴨的脂肪酸合酶、脂肪酸結(jié)合蛋白和圍脂滴蛋白對(duì)應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于低RFI品系(P<0.05)。表2結(jié)果顯示,上述3個(gè)的蛋白在高RFI品系北京鴨中的表達(dá)量均高于低RFI品系。表明不同RFI品系北京鴨脂肪酸合酶、脂肪酸結(jié)合蛋白以及圍脂滴蛋白編碼基因的mRNA表達(dá)水平與蛋白質(zhì)表達(dá)水平一致。

3 討 論

脂肪酸合成和沉積是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，在這個(gè)過程中需要多種蛋白質(zhì)參與。研究表明，脂肪酸合酶是一種催化脂肪酸合成的多酶蛋白，其主要功能是在NADPH存在下催化合成長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸、乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A[18]，這種機(jī)制是將丙二酰輔酶A中的兩個(gè)碳單元依次加入生長(zhǎng)脂肪酸鏈；乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶在許多重要的生化途徑中具有關(guān)鍵的作用[19]，其中就包括β-羥基丁酸、類固醇等各種生物合成途徑。乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶超家族酶可以通過硫脂依賴性克萊森凝聚反應(yīng)機(jī)理催化碳-碳鍵的形成，而碳-碳鍵的形成是生成脂肪酸和聚酮化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟。這些蛋白均在高RFI品系北京鴨的皮脂中高表達(dá)，表明高RFI品系北京鴨的脂肪合成能力要強(qiáng)于低RFI品系北京鴨。

表2低RFI與高RFI北京鴨皮脂之間差異表達(dá)蛋白

Table2ThedifferentiallyexpressedproteinsidentifiedinthesebumofthelowRFIandhighRFIPekinducks

名稱Name登記號(hào)Accession得分Score覆蓋率/%Coverage肽段Peptide差異倍數(shù)Fold change髓磷脂蛋白P0 Myelin protein P0R7VRG8230.1217.3810.15膠原蛋白α-1(II)鏈Collagen alpha-1(II) chain H9L2B7110.742.6830.17脂肪酸合酶Fatty acid synthaseR0KBE21 515.4625.95460.26谷胱甘肽過氧化物酶Glutathione peroxidaseU3I3K155.1222.7530.27核糖核酸酶UK14 Ribonuclease UK14R0JFK776.8210.0940.30磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Phosphoserine aminotransferaseH0YYW725.782.4310.31磷酸烯醇丙酮酸羧激酶Phosphoenolpyruvate carboxykinaseR0J72323.916.9910.32二磷酸核苷激酶Nucleoside diphosphate kinaseO57536133.8033.3360.33谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase U3ISF5210.3021.6270.36載脂蛋白-CA Apolipoprotein CAQ9PRR577.851.0230.36堿性脂肪酸結(jié)合蛋白Basic fatty acid binding proteinD7REA1240.3051.5960.37視黃醛脫氫酶Retinal dehydrogenase 1F1NJC720.014.2710.38α1整合素Alpha1 integrinO4209438.364.2320.41微管蛋白α-5鏈Tubulin alpha-5 chain P0964477.9516.8620.42核心蛋白多糖Decorin R0LLK8498.4843.70120.44乙醇脫氫酶1 Alcohol dehydrogenase 1U3I4I842.966.0810.44蘋果酸脫氫酶Malate dehydrogenaseG1N071427.4353.31120.47丙酮酸羧化酶Pyruvate carboxylaseQ8JHF687.645.9520.51丙酮酸脫氫酶復(fù)合體乙酰轉(zhuǎn)移酶組分U3ICQ7122.0410.2750.52Acetyltransferase component of pyruvatedehydrogenase complex膠原蛋白α-1(I)鏈Collagen alpha-1(I) chainP024571 222.4431.18260.524-氨基-咪唑甲酰胺核糖核酸轉(zhuǎn)化酶IMP環(huán)化水解酶Q5XKY5247.5910.7610.53Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase/IMP cyclohydrolaseC-1-四氫葉酸合成酶C-1-tetrahydrofolate synthaseR0JPE3437.9221.49140.55二氫葉酸還原酶Dihydrofolate reductaseA3RKL398.9914.7940.55二氫硫辛酰脫氫酶Dihydrolipoyl dehydrogenaseU3IR48159.6712.4850.56圍脂滴蛋白PerilipinF6KFT31036.0570.70250.56NAD依賴性脫乙酰酶SIRT2Q68BG125.073.5610.59NAD-dependent deacetylase SIRT2ATP合成酶亞基αATP synthase subunit alphaF1NI22534.9825.13110.62表皮分化特異性蛋白質(zhì)R0K1T639.109.3310.63Epidermal differentiation-specific protein

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

A.細(xì)胞組分；B.生物學(xué)過程；C.分子功能A.Cellular component; B.Biological process; C. Molecular function圖1 皮脂差異蛋白質(zhì)GO分析Fig.1 Gene ontology (GO) analysis of differential proteins in sebum

紅色表示基因融合跡象，綠色表示相鄰跡象，藍(lán)色表示共同跡象，紫色表示試驗(yàn)跡象，黃色表示文本挖掘跡象，淺藍(lán)色表示數(shù)據(jù)庫跡象，黑色表示共表達(dá)跡象，淺紫色表示蛋白質(zhì)同源性Red indicates gene fusions evidence, green indicates neighborhood evidence, blue indicates co-occurrence evidence, purple indicates experimental evidence, yellow indicates text-mining evidence, light blue indicates database evidence, black indicates co-expression evidence, light purple indicates protein homology圖2 不同RFI鴨群體皮脂差異表達(dá)蛋白生物學(xué)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Biological interaction network of the differentially expressed proteins in sebum of the low RFI and high RFI Pekin ducks

同一組數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著The different letters indicate the significant difference between low and high RFI lines圖3 北京鴨不同RFI品系FASN、FABP1、PLIN基因mRNA實(shí)時(shí)定量PCR分析Fig.3 Validation of FASN, FABP1, PLIN at the mRNA level by quantitative real-time PCR analysis in sebum of different RFI line Pekin ducks

載脂蛋白是一組載脂蛋白家族，載脂蛋白C家族是乳糜微粒，為極低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的表面組分，在吸收膳食脂肪期間，載脂蛋白優(yōu)先分布到富含三酰甘油的乳糜微粒和VLDL[20]。基礎(chǔ)脂肪酸結(jié)合蛋白是脂肪酸和其他親脂性物質(zhì)如類花生酸和類視黃醇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族[12,21-23]，這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為可以促進(jìn)脂肪酸在細(xì)胞外和細(xì)胞膜之間的轉(zhuǎn)移[24]，該家族成員的過氧化物酶增殖受體(PPAR)被認(rèn)為可以將親脂性分子從外細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞內(nèi)受體。在人類中，圍脂滴蛋白是與脂肪細(xì)胞脂滴相關(guān)的最豐富的蛋白質(zhì)[25]。圍脂滴蛋白包裹在脂肪細(xì)胞中脂滴的周圍，對(duì)脂肪組織存儲(chǔ)脂滴有著重要的作用[26]。圍脂滴蛋白可作為人體天然脂肪酶的保護(hù)性涂層，如激素敏感性脂肪酶，將三酰甘油分解為甘油和游離脂肪酸，用于代謝過程，而圍脂滴蛋白可以減緩對(duì)脂肪酸的分解[27]，對(duì)脂肪的沉積具有重要的作用。綜上所述，與脂肪合成和沉積相關(guān)的重要蛋白質(zhì)，如脂肪酸合酶、載脂蛋白、基礎(chǔ)脂肪酸結(jié)合蛋白、圍脂滴蛋白、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶等蛋白在高RFI北京鴨品系中高表達(dá)表明,高RFI品系北京鴨具有比低RFI品系北京鴨更強(qiáng)的脂肪沉積能力。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)高、低RFI北京鴨品系差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白中參與脂質(zhì)代謝過程的蛋白數(shù)量最多，主要參與有機(jī)酸代謝、脂類應(yīng)答、脂類合成等生物學(xué)過程；其中脂肪酸合酶、圍脂滴蛋白、載脂蛋白以及脂肪酸結(jié)合蛋白在高RFI品系北京鴨皮脂中高表達(dá)，是高RFI品系北京鴨脂肪沉積能力較強(qiáng)的重要原因。