韓 杰，熊顯榮，王 艷，楊顯英，阿果約達，黃向月，李 鍵

(西南民族大學 生命科學與技術學院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)生活在中國高原地區(qū)，能夠適應高寒、缺氧的生態(tài)環(huán)境，能充分利用高原地區(qū)天然草地為人們提供優(yōu)質健康的食品。此外，牦牛在動物基因遺傳資源研究中也是一個極其珍貴的基因庫，在自然繁殖的牦牛群中，牦牛的繁殖力僅為30%～40%。近些年,雖然對牦牛育種的研究不斷深入，并取得了較大的進展[1]。牦牛繁殖力低的問題嚴重阻礙了牦牛業(yè)及高原地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展。因此，牦牛繁殖性能的研究對提高牧區(qū)人們的生活水平和豐富中國遺傳資源多樣性具有重大意義[2]。

組蛋白去甲基化酶1A(lysine-specific histone demethylase 1A)是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性單胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一員，其主要包括Tower、SWIRM和胺氧化酶3個結構域[3-4]。同時，KDM1A介導的是H3K4me1/2和H3K9me1/2去甲基化作用[5]。對該基因的研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A在哺乳動物組織中普遍表達，并且可通過抑制或激活相關基因轉錄，來調(diào)控DNA損傷、還原轉錄子的活性以及紡錘體和染色體的缺失，進而在多種生物體的生殖細胞系中發(fā)揮重要作用[6-11]。此外，該基因同樣參與了細胞增殖、凋亡和轉移、胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)、機體造血的調(diào)控以及性激素受體介導基因的轉錄調(diào)控等過程[6,12-16]，由此可知，KDM1A基因在哺乳動物生殖發(fā)育調(diào)控、造血系統(tǒng)、多能干細胞的調(diào)控及內(nèi)分泌等相關生物學活動的調(diào)節(jié)中均起重要作用。

關于KDM1A基因的研究主要集中在人和動物的生長發(fā)育及腫瘤等相關疾病上[17-19]，而該基因在牦牛上的研究未見相關報道。為進一步研究KDM1A基因在牦牛睪丸中的表達情況，本研究克隆牦牛KDM1A基因，并對KDM1A序列的蛋白結構和生物信息學功能進行分析和預測；應用實時熒光定量PCR技術檢測牦牛KDM1A基因在睪丸中的表達情況，為進一步研究牦牛的KDM1A基因及其在牦牛生殖生理過程中所發(fā)揮的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol Reagent購自Invitrogen(美國)公司，SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒、Premix TaqTMDNA聚合酶、pMDTM19-T載體均購自TaKaRa(大連)公司，感受態(tài)細胞DH5α購于天根生化科技有限公司，DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司，其他無特殊說明均為國產(chǎn)分析純；熒光定量PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Biodine Rad公司。

1.2 牦牛組織樣本采集

樣本均采自成都青白江屠宰場，無菌采集健康牦牛(4～5歲)的不同組織：心、脾、肝、卵巢、肺、大腦、腎、子宮、睪丸、胃、大腸；采集胎牛(5～6月)、幼年時期(1～2歲)、性成熟時期(4～5歲)、老年時期(9～10歲)牦牛睪丸組織。所需樣本均采集3頭，保存于液氮中。

1.3 牦牛組織總RNA的提取及其完整性檢測

Trizol法提取樣本RNA，對所提取的RNA使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測，結果顯示，兩條以上亮條帶，且無彌散和拖帶的現(xiàn)象，表明所得RNA完整性很好。應用核酸分析儀檢測濃度和OD值，選取OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0的RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，使用GAPDH基因的特異性引物檢測cDNA的質量，對瓊脂糖凝膠電泳結果顯示單一清晰條帶的cDNA進行編號，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計及合成

根據(jù)NCBI已報道的野牦牛(Bosmutus)KDM1A(GenBank登錄號：XM_005905175.2)和GAPDH基因mRNA序列(GenBank登錄號：AC_000162.1)，使用Primer 5.0分別設計引物(表1)。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 目的基因的擴增與克隆

PCR反應體系為25 μL,其中Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL， cNDA 1.0 μL， ddH2O 9.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL。PCR擴增條件： 94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性45 s， 58 ℃退火1 min(3段的退火溫度分別為62.2、56.4和53.0 ℃),72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外光下切取目的條帶并按照膠回收試劑盒說明書回收目的DNA。然后將回收產(chǎn)物與pMDTM19-T載體在16 ℃連接過夜，轉化到感受態(tài)細胞DH5α中。將菌液均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(AMP+)平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑去單菌落，在搖床震蕩培養(yǎng)8 h，以菌液為模板進行PCR鑒定，將呈陽性結果的菌液，送上海生物工程有限公司測序。

表1引物信息

Table1Primerinformation

基因Gene引物序列(5′→3′)Primer sequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProduct size用途UtilizationKDM1A-1F1:GTCCCTGGGTCTGCGACC62.2674KMD1A cDNA擴增R1:GCTGCTGCCAAGCCTGAGAmplification of cDNA of KDM1AKDM1A-2F2:TGGTCTTATCAACTTCGGCATC56.41 167KDM1A cDNA 擴增R2:GGAAGAGGCGGCACAAACTAmplification of cDNA of KDM1AKDM1A-3F3:TCAGGGTGCGAAGTGATAG53.0817KDM1A cDNA 擴增R3:TATGCAGCCAAAGACACGAmplification of cDNA of KDM1AGAPDHF:TGCTGGTGCTGAGTATGTGGTG60.0293內(nèi)參基因擴增 R:TCTTCTGGGTGGCAGTGATGGAmplification reference genesKDM1AF4:GATACTGTGCTTGTCCACCGAG60.0245實時熒光定量PCRR4:GGATTCCCTCCAAGACCTGTTACReal time quantitative PCR

F.正向引物；R.反向引物

F.Forword primer; R.Reverse primer

1.6 牦牛KDM1A基因生物信息學分析

NCBI中ORF Finder分析KDM1A序列的開放閱讀框，并獲得氨基酸序列，BLAST在線工具進行同源性比對；使用在線軟件Protparam、ProtScale(理化性質、疏水性)、SignalP(信號肽)、TMHMM(跨膜區(qū))、NetPhos(磷酸化位點)、SOPMA、SWISS-MODEL(二級結構、三級結構)對KDM1A蛋白進行生物信息學分析；在NCBI中找到需要建樹的相關物種該基因序列，并利用MEGA 5.0軟件進行比對和系統(tǒng)進化樹構建。

1.7 牦牛KDM1A基因組織表達譜檢測

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測KDM1A基因在牦牛心、脾、肝、卵巢、肺、大腸、大腦、腎、子宮、睪丸、胃中的表達。RT-qPCR反應體系為15 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，cNDA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)，重復3次。

1.8 牦牛睪丸組織中KDM1A基因表達分析

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測不同時期牦牛睪丸中KDM1A基因的表達。RT-qPCR反應體系同1.7。每個樣本進行3次重復，用2-△△Ct法對定量結果進行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

熒光定量結果用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。采用SPSS軟件進行顯著性分析，P<0.01差異極顯著，P>0.05差異不顯著，P<0.05差異顯著。

2 結 果

2.1 樣本RNA完整性檢測

用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，結果顯示，所提組織RNA均出現(xiàn)兩條清晰明亮的條帶(18S和28S)，且無彌散和拖帶的現(xiàn)象，無蛋白和DNA等雜質的污染，表明所得RNA完整性很好(圖1)。

1.肝；2.睪丸；3.心；4.脾；5.肺；6.大腸；7.卵巢；8.腎；9.子宮；10.大腦；11.胃；12.胎牛睪丸；13.幼年期睪丸；14.老年期睪丸1.Liver; 2. Testis; 3. Heart; 4. Spleen; 5. Lung; 6. Large intestines; 7. Ovary; 8. Kidney; 9. Uterus; 10. Cerebrum; 11.Stomach; 12. Fetal bovine testis; 13. Juvenile testis; 14. Senile testis圖1 各組織RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Result of agarose gel electrophoresis of different tissues RNA

2.2 牦牛KDM1A基因CDS擴增及克隆測序

以牦牛睪丸組織的總RNA為模板，利用RT-PCR對KDM1ACDS區(qū)進行擴增，得到單一清晰條帶(圖2)，并使用DNAMAN對所得序列進行拼接。獲得核苷酸序列為2 401 bp(圖3)，開放閱讀框為2 331 bp，共編碼776個氨基酸。

M.DL2000 DNA marker；1～3. KDM1A-1、 KDM1A-2、 KDM1A-3的PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker; 1-3.The PCR products of yak KDM1A-1, KDM1A-2, KDM1A-3圖2 牦牛KDM1A基因PCR擴增結果Fig.2 Result for PCR amplification of yak KDM1A

2.3 物種間KDM1A基因同源性比較及進化樹構建

將克隆測序的牦牛KDM1A基因與黃牛(XM_005203319.1)、野牦牛(XM_005905175.2)、綿羊(XM_012152442.2)、山羊(XM_995676880.3)、野豬(NM_001112687.1)、駱駝(XM_010979844.1)、人(KJ_904681.1)、犬(XM_022413506.1)、貓(XM_019836867.1)、馬(XM_014737273.1)、家鼠(NM_001356567.1)、兔(XM_008265704.2)、原雞(XM_015297587.1)、非洲爪蟾(XM_002936594.4)進行比對，同源性分別為99.6%、99.7%、97.6%、97.6%、93.6%、93.8%、90.9%、93.0%、92.9%、93.0%、89.4%、89.5%、81.5%、77.9%。隨后對15個物種KDM1A基因進行系統(tǒng)進化樹構建，結果表明，該基因在物種進化過程中有很高的保守性，其中與牦牛KDM1A基因親緣關系最近的是野牦牛，其次是黃牛、綿羊、山羊等(圖4)。

2.4 牦牛KDM1A蛋白結構和功能預測

采用ExPASY在線工具分析KDM1A蛋白的理化性質，該蛋白分子質量為85.96 ku，分子式C3823H6038N1052O1155S23，等電點5.82，脂肪系數(shù)84.21，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為41.46，帶負電殘基數(shù)(Asp + Glu) 97，帶正電殘基數(shù)(Arg + Lys) 85。推測該蛋白可能是不穩(wěn)定的酸性蛋白。出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基有Glu(8.1%)、Val(7.1%)、Leu(9.9%)、Ala(8.4%)，且不包括吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。疏水性預測分析，KDM1A蛋白親水性分值在第15位最小為-3.144，第628位最大為2.656，總平均親水性-0.378<0，且較大多數(shù)氨基酸殘基具有親水性，推測為親水性蛋白，與所分析的蛋白理化性質結果一致。SignalP、TMHMM分析表明，KDM1A蛋白為不含跨膜結構和信號肽的蛋白。蛋白修飾磷酸化位點預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白有31個Ser位點，28個Thr位點和14個Tyr位點。KDM1A蛋白二級結構預測知，295個α-螺旋占38.02%，64個β-轉角占8.25%，271個無規(guī)卷曲占34.92%，146個延伸鏈占18.81%(圖5)，同時該蛋白的三級結構進一步驗證了二級的預測。

上行表示牦牛KDM1A基因核苷酸序列；下行表示推測的氨基酸序列；下劃線表示突變堿基；*表示終止密碼子The upper lines show the nucleotide sequences and the lower lines show the deduced amino acid sequences.Base mutations are underlined;* shows termination codon圖3 牦牛KDM1A基因核苷酸及其推測的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences of yak KDM1A

2.5 牦牛KDM1A基因的組織表達譜

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR檢測KDM1A基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、卵巢、子宮、胃、睪丸、大腦組織中表達，結果顯示，其在牦牛各組織中普遍表達，但仍存在差異，其中該基因在睪丸和肝中的表達相對較高，心和卵巢中的表達次之，脾、肺、腎、子宮、大腦、大腸、胃中的表達相對較低(圖6)。

2.6 牦牛不同發(fā)育時期睪丸中KDM1A基因的表達

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR檢測KDM1A基因在牦牛不同時期睪丸中mRNA的表達情況(圖7)。結果顯示，KDM1A基因從胎牛～老年期睪丸中表達水平呈明顯的先上升后下降趨勢，以胎牛時期該基因的表達量作為參考，幼年和老年期約為胎牛時期的15倍(P<0.01)；以幼年期的作為參考，該基因在性成熟時期的表達量顯著高于幼年期，約為其表達量的1.6倍(P<0.05)，與老年期睪丸中KDM1A的表達水平差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同物種間的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of KDM1A of various species

圖5 牦牛KDM1A蛋白三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of KDM1A protein of yak

3 討 論

KDM1A是位于細胞核上的一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性單胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一員。KDM1A主要催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的去甲基化，并且可通過調(diào)控相關基因表達來介導精子的發(fā)生過程[20]。本研究克隆獲得牦牛KDM1A基因核苷酸序列，與野牦牛對比，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)除了存在4處堿基突變，使編碼區(qū)第28位、35位、223位氨基酸，變化由K→T，D→G，R→I，還發(fā)現(xiàn)從250 bp開始，比野牦牛多出了連續(xù)的60 bp堿基，導致多編碼20個氨基酸，依次是SGQAGGLQDDSSGGYGDGQA。但這種氨基酸的突變是否會導致蛋白功能改變，有待深入的研究。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與野牦牛、黃牛的同源性最高，暗示牦牛KDM1A基因在進化過程中具有較高的保守性。

組織間比較：不同字母代表差異顯著(P<0.05)Comparison among tissues: Different letters show significant differences(P<0.05)圖6 KDM1A基因在牦牛不同組織中的表達Fig.6 The expression of KDM1A in yak different tissues

與胎牛比較：**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(P<0.05)Comparison with fetal bovine: ** show very significant difference(P<0.01)，* show significant differences(P<0.05)圖7 KDM1A基因在牦牛不同發(fā)育時期睪丸中的表達水平Fig.7 The expression of KDM1A in different growth periods of yak testis

組織表達譜分析結果發(fā)現(xiàn)，該基因mRNA在所選牦牛組織中均有表達，這與文獻[8]的結果一致，且其表達量在睪丸、肝中較高，在睪丸中表達量高的原因可能和其在調(diào)控精子形成過程中起重要作用有關[20]。其在肝中表達量較高可能是和Wnt信號通路調(diào)節(jié)肝干細胞增殖、分化以及谷氨酰胺新陳代謝作用相關。已有研究證明，Wnt/β-Catenin信號通路在肝的發(fā)育、再生、新陳代謝以及氧化應激等方面發(fā)揮著重要作用，其中編碼谷氨酰胺轉移酶、鳥氨酸轉氨酶和谷氨酰胺轉運體(參與谷氨酰胺新陳代謝活動的酶)基因的表達受該通路的調(diào)控作用。敲減KDM1A可解除Wnt信號通路的抑制，進一步調(diào)控與該通路相關基因的表達[21-24]。

睪丸是產(chǎn)生雄激素、精子的重要場所，其包括不同發(fā)育階段的生精細胞、支持細胞和分泌雄性激素以維持雄性功能和促進精子形成的間質細胞等多種功能各異的細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A可通過調(diào)控相關基因的表達活性來介導精原干細胞的維持和分化過程，進而在精子發(fā)育和形成過程中發(fā)揮至關重要的作用[21]。

本試驗采用實時熒光定量PCR的方法檢測了該基因在不同發(fā)育時期牦牛睪丸中的表達差異。結果表明，KDM1AmRNA在不同時期睪丸中均有表達，但其表達量存在差異，表明KDM1A基因在睪丸發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。胎牛(5～6月)時期的睪丸僅有少量支持細胞、未分化的精原干細胞，出生后，隨著年齡增長，性成熟后(3～4歲)的牦牛睪丸較幼年期(1～2歲)的變化較大，主要包括間質細胞數(shù)量、生精上皮和生精細胞數(shù)量種類以及生精細胞層的明顯增厚、增多[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體多存在于間質細胞和支持細胞，同時，KDM1A可與該受體結合，調(diào)控其依賴性基因的表達，進一步介導睪丸發(fā)育以及睪酮調(diào)控精子發(fā)生的過程。因此，隨著幼年牦牛步入性成熟，其睪丸內(nèi)的間質細胞增多，迫使了更多的雄激素受體激活以便于睪丸的正常發(fā)育以及保證精子的發(fā)生過程的順利進行[26-27]。綜上表明，KDM1A在精子發(fā)生的分化過程發(fā)揮著重要功能。因此，從胎牛(出生前)～性成熟(3～4歲)的不同時期，KDM1A表達量呈顯著上升趨勢。這一變化主要和睪丸發(fā)育過程中間質細胞以及生精細胞種類和數(shù)量增多有關，也是精子發(fā)生所必須的變化趨勢。然而隨著年齡增長，生精功能逐漸下降，生精細胞層數(shù)也明顯減少，精原細胞、精母細胞和精子細胞均有不同程度的減少，精子細胞數(shù)明顯減少，老年期較性成熟時期的KDM1A表達量又顯著下降。由此推測，KDM1A基因可能參與了牦牛睪丸發(fā)育過程。

4 結 論

本研究成功克隆了牦牛KDM1A序列。生物信息學分析表明，KDM1A基因CDS區(qū)的保守性較高。同時，KDM1A基因在牦牛不同發(fā)育時期睪丸中的表達規(guī)律表明，該基因可能參與牦牛睪丸的發(fā)育。此結果為進一步研究KDM1A基因對牦牛生殖機能的調(diào)控提供基礎資料。