魏鳳靈，張瑩瑩，許瑞勤，李 聞，李想通，孫楊楊，張留君，楊國宇，夏平安，張改平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的高度接觸性傳染病。其特征為母豬的流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎；幼齡仔豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病和大量死亡[1]。該病是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV是正鏈單股RNA病毒，其基因組全長約 15 kb，含 10 個開放閱讀框，其中ORF1a 和ORF1b 主要編碼與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的16 種非結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]，其中ORF2～5至少編碼 7種囊膜糖蛋白，包括主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5蛋白和次要結(jié)構(gòu)蛋白GP4、GP3、GP2a 蛋白以及小分子疏水蛋白 E(GP2b)和ORF5a 蛋白。ORF6編碼M蛋白，ORF7編碼N蛋白(核衣殼蛋白)[4]。

PRRSV是一種豬免疫抑制病病毒，早期感染可誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，感染后期Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生則受到明顯抑制[5-8]。PRRSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生是一個動態(tài)平衡過程，受病毒自身成分和宿主細(xì)胞自身成分的雙重調(diào)節(jié)。目前有關(guān)PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制研究得比較清楚，而其結(jié)構(gòu)蛋白調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制研究得相對較少。免疫細(xì)胞表面存在著調(diào)控天然免疫的酪氨酸受體分子，包括含ITAM激活型基序的激活型受體和含ITIM抑制型基序的抑制型受體。激活型ITAM基序介導(dǎo)抗病毒炎癥因子分泌的信號具有雙重性[9-11]，而抑制型ITIM基序主要是反向激活Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。序列分析顯示PRRSV GP3、GP5和M等結(jié)構(gòu)蛋白中都存在一段ITIM抑制基序，但該基序在PRRSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生過程中是否具有調(diào)節(jié)作用還不清楚。

SHP-1和SHP-2都屬于非受體樣的蛋白酪氨酸磷酸酶，是胞內(nèi)負(fù)調(diào)控分子，在細(xì)胞磷酸化調(diào)控的信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。SHP-1可抑制TLR信號介導(dǎo)的NF-κB和MAPK的激活，從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但有研究表明SHP-1可通過相反的方式調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，對TLR和RIG-I介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生有激活作用[12]。研究表明SHP-2可抑制TLR3-TRIF依賴型信號通路，負(fù)調(diào)控JAK激酶以及IFN-α和IFN-γ啟動的STAT轉(zhuǎn)錄信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子[13-14]。

本試驗(yàn)將通過檢測TLR介導(dǎo)信號通路中TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB(p65)、IFN-β等關(guān)鍵分子及SHP-1、SHP-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化及其相互關(guān)系，來研究PRRSV M蛋白中ITIM抑制基序在PRRSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生中作用，為進(jìn)一步明確PRRSV感染誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的平衡作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 載體、菌種、病毒、細(xì)胞株

載體pcDNA3.0、DH5α菌株、PRRSV Hn-1/06毒株(TCID50為104.8·mL-1)及Marc-145細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Oligod(T)、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、RIPA裂解液、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ等均購自寶生物工程(大連)有限公司，鼠抗PRRSV Hn-1/06毒株IgG(ELISA 1∶6 400)由本實(shí)驗(yàn)室保存，兔抗鼠HRP標(biāo)記的IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

ORF6基因片段長525 bp，其中 ITIM基序?qū)?yīng)堿基位點(diǎn)為70—87 bp，并將ORF6基因分成兩段，即為片段1(1—69 bp)和片段2(88—525 bp)，簡稱為D1和D2。設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF6、D1、D2片段引物，序列如下,GP6 F: 5′-CCCAAGCTTATGGGG- TCGTCCTTAGATGA-3′，GP6 R：5′-CGGAATTCTTATTTGGCATATTTGACAAGG-3′；D1 F:5′- CCCAAGCTTATGGGGTCGTCCTTAGATGA-3′，D1 R:5′-CATATATCATAGAAAACGCCAAA-AGCACC-3′；D2 F：5′-GGCGTTTTCTATGAT-ATATGCCCTAAAGGTGAG-3′，D2 R：5′-CG-GAATTCTTATTTGGCATATTTGACAAGG-3′(斜體及下劃線表示酶切位點(diǎn))。采用SOE-PCR擴(kuò)增GP6△ITIM片段。分別將ORF6和GP6△ITIM基因片段連接至載體pcDNA3.0中，測序正確后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測

將Marc-145 細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞長至約80%時進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。收集48 h轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，離心取上清，用Western blot方法檢測目的蛋白的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測

將Marc-145 細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞長至約80%時進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具體操作參照LipofectamineTM2000試劑說明書。

分別收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12、24、36及48 h的細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中不同時間段TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB及IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，TRIF、NF-κB：64 ℃ 34 s，MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7：62 ℃ 34 s，IFN-β：61 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。

1.6 靶標(biāo)SHP-1、SHP-2的siRNA干擾效率檢測

根據(jù)SHP-1、SHP-2基因序列，分別設(shè)計(jì)SHP-1-siRNA-781、SHP-1-siRNA-832、SHP-1-siRNA-2000、SHP-2-siRNA-420、SHP-2-siRNA-639、SHP-2-siRNA-1335 6條RNAi靶序列，同時設(shè)計(jì)一條陰性對照siRNA，如表1所示。將上述siRNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，設(shè)置正常Marc-145細(xì)胞作為空白對照，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h。收集細(xì)胞，熒光定量PCR方法檢測SHP-1、SHP-2基因的干擾效率。

表1SHP-1、SHP-2基因siRNA片段

Table1siRNAsegmentsofSHP-1andSHP-2

基因Gene靶點(diǎn)NumbersiRNA片段(5′→3′)siRNA segmentsSHP-1781GCAAGAACCAGGGUGACUUTTAAGUCACCCUGGUUCUUGCTT832CCCAUAUUCGGAUCCAGAATTUUCUGGAUCCGAAUAUGGGTT 2 000GCAGGAAAGUCUGUUUCAUTTAUGAGGCAGACUUUCCUGCTTSHP-2420CCAGUAUUACAUGGAACAUTTAUGUUCCAUGUAAUACUGGTT639GCGCACUGGUGAUGACAAATTUUUGUCAUCACCAGUGCGCTT1 335GCGUGUUAGGAAUGUCAAATTUUUGACAUUCCUAACACGCTTNegative controlUUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.7 SHP-1與SHP-2的沉默試驗(yàn)

將SHP-1-siRNA、SHP-2-siRNA干擾效率最高的序列分別與重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GP6、 pcDNA3.0-GP6△ITIM共轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞，熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GP6與pcDNA3.0-GP6△ITIM的鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GP6與pcDNA3.0-GP6△ITIM測序并分析比對，結(jié)果與其目的片段相似性高達(dá)100%，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 目的蛋白的檢測

收集重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM及空載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染48 h后的Marc-145 細(xì)胞，用鼠抗PRRSV Hn-1/06 IgG和兔抗鼠HRP-IgG進(jìn)行Western blot檢測。pcDNA3.0-GP6與pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)了大小在19 ku左右的條帶，而空載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染組與Marc-145 細(xì)胞空白組無此條帶(圖1)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. Marc-145細(xì)胞空白對照組；2. pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組；3. pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組；4. pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組M. Protein marker；1. Normal Marc-145 cells group；2. Transfection of pcDNA3.0-GP6；3. Transfection of pcDNA3.0；4. Transfection of pcDNA3.0-GP6△ITIM圖1 目的蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig.1 Western blot analysis of target proteins

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

將pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM分別轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞，設(shè)Marc-145 細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)12、24、36及48 h后用熒光定量PCR方法檢測相應(yīng)細(xì)胞中MyD88、TRAF6、TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7、IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，如圖2所示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-GP6后與對照組相比，MyD88、TRAF6、NF-κB、IRF3、IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24、36 及48 h四個時間段均升高，且極顯著高于對照組(P<0.01或P<0.001)，而TRIFmRNA轉(zhuǎn)錄水平在24及36 h時間段均極顯著高于對照組(P<0.001)，IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24、36及48 h三個時間段均極顯著高于對照組(P<0.001)，說明GP6蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)IFN-β及其信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平。pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組相比，IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24、36及48 h三個時間段均顯著上升(P<0.05或P<0.001)，TRIFmRNA轉(zhuǎn)錄水平在24及36 h極顯著上升(P<0.001)，IRF3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24、36及48 h四個時間段均極顯著上升(P<0.01或P<0.001)；IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24、36及48 h三個時間段均極顯著上升(P<0.001)；NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12 h極顯著低于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組(P<0.001)，24 h后開始上升，36及48 h則極顯著高于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組(P<0.001)；而MyD88 mRNA轉(zhuǎn)錄水平則在12、24及36 h極顯著下降(P<0.001)，TRAF6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24及36 h顯著下降(P<0.05或P<0.001)。這說明IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高可能與TLR介導(dǎo)的信號通路中TRIF、IRF3、IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高相關(guān)，與MyD88、TRAF6分子不相關(guān)，而NF-κB則在36 h后作用顯著。

A. MyD88；B. TRIF；C. TRAF6；D. NF-κB； E. IRF3；F. IRF7；G. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05圖2 正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM質(zhì)粒后關(guān)鍵細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.2 The cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0, pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

2.4 Poly(I:C)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平

用濃度為500 ng·mL-1Poly(I:C) 分別刺激正常Marc-145 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-GP6的Marc-145 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-GP6△ITIM的Marc-145 細(xì)胞，培養(yǎng)12、24、36及48 h后用熒光定量PCR方法檢測相應(yīng)細(xì)胞中TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7及IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平。如圖3所示，Poly(I:C) 刺激組的IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平及其信號通路中的TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7及IFN-β關(guān)鍵分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12～48 h均高于Marc-145 細(xì)胞對照組，其中TRIFmRNA轉(zhuǎn)錄水平在12～36 h差異極顯著(P<0.01或P<0.001)，IRF3及IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24 h差異極顯著(P<0.01或P<0.001)，NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24、36 h差異極顯著(P<0.001)，IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在 24～48 h差異極顯著(P<0.001)，說明Poly(I:C) 可增強(qiáng)IFN-β及關(guān)鍵分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平； pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組的IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在36及48 h高于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組(缺失轉(zhuǎn)染組)，且36 h差異極顯著(P<0.01)，其信號通路中的TRIFmRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24、36及48 h四個時間段都高于缺失轉(zhuǎn)染組，其中24與36 h差異顯著(P<0.001或P<0.05)；IRF3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24及36 h顯著高于缺失轉(zhuǎn)染組(P<0.05或P<0.01)；IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在36及48 h顯著高于缺失轉(zhuǎn)染組(P<0.05或P<0.01)；NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平在36 h極顯著高于缺失轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。這些結(jié)果顯示M蛋白的ITIM基序可上調(diào)由Poly(I:C) 刺激產(chǎn)生的IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，而TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等關(guān)鍵分子在該信號通路中發(fā)揮作用。

A. TRIF；B. NF-κB；C. IRF3；D. IRF7； E. IFN-β； ***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05圖3 Poly(I:C)刺激后正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM質(zhì)粒后關(guān)鍵細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 Effect of Poly(I:C) on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

2.5 靶標(biāo)SHP-1、SHP-2的siRNA干擾效率檢測

SHP-1、SHP-2的siRNA干擾效率檢測結(jié)果如圖4所示，空白對照組與陰性對照組的mRNA轉(zhuǎn)錄水平基本一致，6條干擾序列在12～48 h時間段均能降低靶基因SHP-1、SHP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其中SHP-1-siRNA-781在12、36及48 h顯著下調(diào)SHP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.001或P<0.05)，SHP-2-siRNA-1335在24、36及48 h極顯著下調(diào)SHP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.001)，結(jié)果表明，SHP-1-siRNA-781與SHP-2-siRNA-1335的干擾效果最優(yōu)。

A. SHP-1；B. SHP-2； ***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05圖4 siRNA對SHP-1、SHP-2的干擾情況Fig.4 The effects of siRNA on SHP-1 or SHP-2 gene of Macr-145 cells

2.6 沉默SHP-1和SHP-2后相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

將SHP-1-siRNA-781、SHP-2-siRNA-1335分別與pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞，培養(yǎng) 12、24、36及48 h后用熒光定量PCR方法檢測相應(yīng)細(xì)胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB及IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平。如圖5所示，pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組TRIF、IRF3、IRF7及NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別在24～36 h、24～48 h、12～48 h、12 h不同時間段內(nèi)均顯著低于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組(P<0.05、P<0.01或P<0.001)；pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12～48 h均低于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組(缺失轉(zhuǎn)染組)，36及48 h時期差異極顯著(P<0.001)。結(jié)果顯示，沉默SHP-1后，M蛋白的ITIM基序能夠顯著下調(diào)細(xì)胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，表明SHP-1分子可能是ITIM基序激活調(diào)控TLR3-TRIF-IFN-β信號通路中的關(guān)鍵分子。如圖6所示，沉默SHP-2后，pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組TRIFmRNA轉(zhuǎn)錄水平12及48 h高于缺失轉(zhuǎn)染組但差異不顯著，24及36 h極顯著低于缺失轉(zhuǎn)染組(P<0.01或P<0.001)；pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組IRF3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12及48 h顯著高于缺失轉(zhuǎn)染組(P<0.05或P<0.001)，24及36 h低于缺失轉(zhuǎn)染組但差異不顯著；pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、24、36及48 h高于缺失轉(zhuǎn)染組，12及36 h差異極顯著(P<0.01)；pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12及48 h高于缺失轉(zhuǎn)染組，12 h差異極顯著(P<0.001)，24及36 h均低于缺失轉(zhuǎn)染組，24 h差異極顯著(P<0.01)；pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12、36及48 h均高于缺失轉(zhuǎn)染組，且12及36 h差異顯著(P<0.05或P<0.001)，而24 h低于缺失轉(zhuǎn)染組且差異極顯著(P<0.001)；結(jié)果表明，瞬時干擾SHP-2后， ITIM基序?qū)RIF、IRF3、NF-κB及IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)均為先升高，再降低，后趨于穩(wěn)定，對IRF7則能夠持續(xù)上調(diào)到48 h。綜上所述， SHP-1分子可能是ITIM基序激活調(diào)控TLR3-TRIF-IFN-β信號通路中的關(guān)鍵分子，而ITIM 基序與SHP-2在該通路中的調(diào)節(jié)關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。

3 討 論

本研究中，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.0-GP6轉(zhuǎn)染組TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組，而MyD88、TRAF6轉(zhuǎn)錄水平低于pcDNA3.0-GP6△ITIM轉(zhuǎn)染組。這一結(jié)果說明M蛋白ITIM基序的缺失影響了IFN-β的產(chǎn)生，而TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等關(guān)鍵分子在IFN-β的產(chǎn)生中發(fā)揮作用，MyD88 和TRAF6關(guān)鍵分子可能作用不明顯。由于PRRSV復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙股RNA可被宿主細(xì)胞位于吞噬體膜上的TLR3受體識別，激活TLR3信號通路，招募TRIF，隨后TRIF與TBK、IKKi相互作用，TBK和IKKi作用于IRF3使其磷酸化，磷酸化后的IRF3轉(zhuǎn)入細(xì)胞核激活Ⅰ型干擾素啟動子，誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生[15]，而病毒蛋白等自身成分可對TLR3-TRIF信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[16]，本試驗(yàn)結(jié)果初步證明含有ITIM基序的病毒蛋白可正調(diào)節(jié)TLR3-TRIF信號通路，增強(qiáng)IFN-β的產(chǎn)生。

A.TRIF；B. IRF3；C. IRF7；D. NF-κB；E. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05圖5 SHP-1-siRNA對正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM質(zhì)粒后關(guān)鍵細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化的影響Fig.5 Effect of SHP-1-siRNA on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0, pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

A.TRIF；B. IRF3；C. IRF7；D. NF-κB；E. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05圖6 SHP-2-siRNA對正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM質(zhì)粒后關(guān)鍵細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Effect of SHP-2-siRNA on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

本研究通過Poly(I:C) 刺激試驗(yàn)證明M蛋白的ITIM基序能進(jìn)一步上調(diào)Poly(I:C) 激活通路中的TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等關(guān)鍵因子以及IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了M蛋白的ITIM基序可經(jīng)TLR3-TRIF信號通路對IFN-β的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。

筆者以前的研究發(fā)現(xiàn)含有ITIM基序的抑制型受體FcγR IIb被選擇性激活后通過增加Ⅰ型干擾素水平來抑制PRRSV的復(fù)制[17]。有資料表明Ly49Q 受體分子在胞漿樣樹突狀細(xì)胞(pDC)膜上高度表達(dá)，其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有的ITIM基序能使Ly49Q 受體分子正向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[18]；Trem系列蛋白分子在胞漿樣樹突狀細(xì)胞(pDC) 膜上也高度表達(dá)，其中Trem6的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有ITIM基序是TLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生所必需的[19]。這些研究結(jié)果表明抑制型ITIM基序主要是反向激活Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，與筆者的研究結(jié)果一致，但相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

研究表明滅活的IRAK1能夠增加由TRIF和RIG-I誘導(dǎo)激活的IRF3/IRF7磷酸化，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[20]，也有文獻(xiàn)報道，SHP-1能夠直接結(jié)合并抑制激酶IRAK1的活化來促進(jìn)TLR和RIG-I激活的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[13]，這是由于IRAK1激酶的結(jié)構(gòu)域中包含ITIM基序，SHP-1結(jié)合IRAK1激酶結(jié)構(gòu)域中的ITIM基序后可能通過競爭或空間位阻機(jī)制抑制IRAK1激酶活性以及IRAK1自身磷酸化，從而解除了IRAK1對I型干擾素產(chǎn)生的抑制作用，這些研究結(jié)果說明，SHP-1可通過與含ITIM基序的IRAK1分子結(jié)合激活Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究證明沉默SHP-1后，M 蛋白的ITIM基序可顯著下調(diào)細(xì)胞中TRIF、IRF3、IRF7、IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，這說明SHP-1在PRRSV M蛋白的ITIM基序介導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號通路中具有激活調(diào)節(jié)作用，然而其相關(guān)機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。研究表明，SHP-2僅特異性抑制TRIF依賴性促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，與SHP-1可發(fā)揮協(xié)同作用，但更多時候，SHP-1和SHP-2對信號傳導(dǎo)具有相反的調(diào)節(jié)作用[15, 21]。本研究證明沉默SHP-2后，ITIM基序?qū)RIF、IRF3、NF-κB、IFN-β的調(diào)節(jié)規(guī)律均為先升高，再降低，后趨于穩(wěn)定，這說明SHP-2在PRRSV M蛋白的ITIM基序介導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號通路中作用不明顯。

4 結(jié) 論

含有ITIM基序的PRRSV M蛋白可正調(diào)節(jié)TLR3-TRIF信號通路，增強(qiáng)IFN-β的產(chǎn)生。ITIM基序能上調(diào)Poly(I:C) 激活通路中的TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等關(guān)鍵因子以及IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。SHP-1在PRRSV M蛋白的ITIM基序介導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號通路中具有激活調(diào)節(jié)作用，SHP-2在PRRSV M蛋白的ITIM基序介導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號通路中作用不明顯。