段志強，鄧珊珊，袁 超，高洪波，嵇辛勤，趙佳福，阮 涌

(貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員，是一種有囊膜、含有單股負鏈不分節(jié)段基因組的RNA病毒，其基因組可編碼8種病毒蛋白[1]。M蛋白是NDV基因組編碼的一種非糖基化膜相關(guān)蛋白，位于病毒囊膜內(nèi)表面，在病毒基因組復(fù)制轉(zhuǎn)錄以及子代病毒粒子組裝和釋放過程中發(fā)揮了重要作用[2]。與大多數(shù)副黏病毒的M蛋白一樣，NDV M蛋白也是一種細胞核-細胞質(zhì)穿梭蛋白[3]，其細胞核定位主要是由核轉(zhuǎn)運受體蛋白importin β1識別和結(jié)合M蛋白中存在的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，然后在RanGTP的幫助下完成入核轉(zhuǎn)運[4-5]。近年來的研究結(jié)果表明，NLS介導(dǎo)的病毒蛋白細胞核定位與病毒的復(fù)制增殖過程密切相關(guān)，如Sanchez等[6]對A型流感病毒NP蛋白NLS進行突變，發(fā)現(xiàn)突變體病毒不能有效地形成病毒核糖核蛋白體，并且病毒粒子的裝配受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致病毒的復(fù)制能力顯著下降；Li等[7]發(fā)現(xiàn)NLS介導(dǎo)的禽呼腸孤病毒p17蛋白細胞核定位能有效促進病毒誘導(dǎo)的細胞自噬并且增強病毒的復(fù)制能力；Chen等[8]首次鑒定了桿狀病毒LEF-11蛋白NLS，發(fā)現(xiàn)該NLS介導(dǎo)的LEF-11蛋白細胞核定位對病毒基因組DNA的復(fù)制非常重要。

目前，對其他副黏病毒(如呼吸道合胞體病毒、麻疹病毒和尼帕病毒)M蛋白功能的研究發(fā)現(xiàn)，NLS介導(dǎo)的M蛋白細胞核定位對副黏病毒的復(fù)制進程和致病性均有重要作用[9]。作為副黏病毒重要成員之一的NDV，其M蛋白細胞核定位與NDV致病性的關(guān)系尚不清楚。課題組前期通過反向遺傳操作技術(shù)拯救出M蛋白NLS突變體NDV，發(fā)現(xiàn)其M蛋白不能進入病毒感染細胞的細胞核，并且突變體病毒的毒力、HA效價和在細胞中的復(fù)制能力均顯著降低[5]。為進一步研究M蛋白NLS突變對NDV致病性的影響，本研究將M蛋白NLS突變體NDV感染4周齡SPF雞，檢測雞喉頭和泄殖腔排毒情況、組織臟器中病毒含量，并對免疫器官進行組織病理切片觀察，以及分析免疫器官中M蛋白的表達量和相關(guān)細胞因子的表達變化，為后續(xù)深入研究M蛋白細胞核定位在NDV致病性中的作用奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、雞胚和SPF雞

表達GFP的重組NDV rSS1GFP(MDT為54 h、ICPI為1.88，TCID50為108.79·mL-1，HA效價為8log2)以及M蛋白NLS突變的重組NDV rSS1GFP-M/NLSm(MDT>120 h、ICPI為1.67，TCID50為106.17·mL-1，HA效價為4log2)經(jīng)過3次空斑純化后由本實驗室保存[5]。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物公司，孵化至10日齡使用；4周齡SPF雞由SPF雞胚孵化飼養(yǎng)而成。

1.2 主要試劑

TRIzol Reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒購自Thermo Fisher公司；TB GreenTMPremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；青鏈霉素混合液(100×)、10×PBS緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；10%中性甲醛固定液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司；NP-40裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、抗β-actin鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗NDV M蛋白鼠多克隆抗體由實驗室制備保存；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 病毒對SPF雞的致病性試驗

1.3.1 試驗雞分組與設(shè)計 將48只4周齡SPF雞隨機分為3組，每組16只(其中10只用于臨床癥狀觀察、6只用于樣品采集)，分別接種rSS1GFP、rSS1GFP-M/NLSm和PBS。試驗組雞以點眼滴鼻的方式接種106.0TCID50的病毒，0.1 mL·只-1；對照組的雞接種0.1 mL PBS。每天觀察和記錄各組雞的臨床癥狀、發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，及時解剖死亡雞并觀察其組織病理變化。

1.3.2 試驗雞喉頭和泄殖腔排毒檢測 在病毒感染后的第3、5天分別采集各組雞的喉頭和泄殖腔拭子，經(jīng)過處理后接種10日齡SPF雞胚分離病毒，檢測喉頭和泄殖腔的排毒情況。對接種后24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集雞胚尿囊液再次接種，并檢測各代尿囊液血凝性，根據(jù)文獻方法計算病毒的EID50[10]。

1.3.3 試驗雞組織器官病毒含量檢測 在病毒感染后的第5天分別剖殺各組試驗雞，每組3只，無菌采集心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、十二指腸、胸腺、法氏囊等10種組織樣品(質(zhì)量在0.1～0.5 g)，研磨后離心分離上清并接種10日齡SPF雞胚，根據(jù)文獻方法計算病毒的EID50[10]。

1.3.4 試驗雞免疫器官病理組織學(xué)觀察 在病毒感染后的第5天，分別采集各組雞的免疫器官(脾、胸腺、法氏囊)固定于10%中性甲醛固定液，按病理切片制作方法對組織樣品進行脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，觀察各組雞免疫器官的病理組織學(xué)變化。

1.4 M蛋白在試驗雞免疫器官中的表達量檢測

分別采集病毒感染試驗雞后第5天的免疫器官(脾、胸腺、法氏囊)，液氮研磨后進行裂解，4 ℃高速離心后取上清并測定組織蛋白含量。從不同試驗組組織中各取20 μg總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液煮沸處理后進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜。用5%脫脂乳把PVDF膜于37 ℃封閉1 h，然后加入1∶1 000稀釋的抗M蛋白鼠多克隆抗體和抗β-actin鼠單克隆抗體于37 ℃孵育2 h；TBST洗3次，加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)于37 ℃孵育1 h；TBST洗3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯色。使用ImageJ 1.2.4軟件分析不同試驗組免疫器官中M蛋白的相對表達量。

1.5 試驗雞免疫器官細胞因子基因表達水平檢測

在病毒感染后的第5天，分別采集各組雞的免疫器官(脾、胸腺、法氏囊)，采用熒光定量PCR方法檢測雞感染病毒后免疫器官中相關(guān)細胞因子(包括IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-λ)的基因表達變化。參照GenBank收錄的細胞因子基因序列，設(shè)計特異性引物(表1)，利用TB GreenTMPremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL。細胞因子基因的相對表達水平以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算細胞因子基因在免疫器官中的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 雞感染病毒后的臨床癥狀及病理變化

4周齡SPF雞感染親本病毒rSS1GFP后的第3天開始出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、呆立不動、排黃綠色稀糞、翅膀下垂；第4天表現(xiàn)為張口呼吸、頭頸震顫、歪頭、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，并且有2只雞死亡；第5天雞全部死亡。剖檢觀察發(fā)現(xiàn)病死雞具有典型的ND病理變化，如氣管和腺胃乳頭嚴(yán)重出血、脾腫大壞死、胰充血和出血、腸黏膜出血、胸腺和法氏囊萎縮(圖略)。

4周齡SPF雞感染突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm后于第5天部分雞出現(xiàn)輕微的精神沉郁；到第6天有2只雞出現(xiàn)嚴(yán)重的精神沉郁、張口呼吸、頭頸震顫和歪頭，并且有1只雞死亡；第7天有2只雞死亡，在后續(xù)試驗中未出現(xiàn)雞的死亡。剖檢觀察發(fā)現(xiàn)病死雞僅有輕微的病理變化，如脾腫大、胸腺出血(圖略)。接種PBS的對照組雞均未表現(xiàn)臨床癥狀和出現(xiàn)死亡。rSS1GFP感染組、rSS1GFP-M/NLSm感染組和PBS對照組的雞存活率分別為0%、70%和100%(圖1)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變降低NDV對雞的致死率。

2.2 雞感染病毒后的排毒情況檢測

對雞感染病毒后的喉頭和泄殖腔排毒情況進行檢測，結(jié)果顯示雞感染rSS1GFP后的第3天喉頭和泄殖腔排毒量最高，分別為103.4±0.3和101.9±0.5EID50·0.1 mL-1，但在第5天出現(xiàn)下降；而雞感染rSS1GFP-M/NLSm后的第3天喉頭和泄殖腔未檢測到排毒，但在第5天檢測到的喉頭和泄殖腔排毒量要明顯比rSS1GFP感染組低；對照組雞的喉頭和泄殖腔未檢測到排毒(表2)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變減弱了病毒感染雞后的排毒能力。

表1熒光定量PCR檢測細胞因子基因表達的引物序列

Table1PrimersusedtodetecttheexpressionofcytokinesbyqRT-PCR

基因GeneGenBank收錄號GenBank No.引物名稱Primer name引物序列(5′→3′)Primer sequences退火溫度/℃Tm片段大小/bpSizeIL-1βNM_204524IL-1β-FTCTACATGTCGTGTGTGATGAGCG58115IL-1β-RTCCAGGCGGTAGAAGATGAAGCGIL-6NM_204628IL-6-FGCCTGTTCGCCTTTCAGACCT58148IL-6-RGGGATGACCACTTCATCGGGIL-10AJ621254IL-10-FGGAGCTGAGGGTGAAGTTTGAGG58150IL-10-RGTGTAGAAGCGCAGCATCTCTGAIFN-αGU119896IFN-α-FAATGCTTGGACAGCAGCGACAC58108IFN-α-RCGTTGTCTTGGAGGAAGGTGTGGIFN-βGU119897IFN-β-FTGCACAGCATCCTACTGCTCTTG5894IFN-β-RTTCCAAGAGAAGTTGGCATCCTGIFN-λEF587763IFN-λ-FGAGGATGAAGGAGCAGTTTGAAGAC58161IFN-λ-RGGTTTGTGAGCACGGTGATGGβ-actinL08165actin-FCCCAAAGCCAACAGAGAGAAGATG58149actin-RTGGGTAACACCATCACCAGAGTCC

圖1 雞感染病毒后的存活率Fig.1 The survival rate of virus-infected experimental chickens

2.3 雞感染病毒后的組織病毒含量檢測

對雞感染病毒后第5天不同組織中的病毒含量進行測定，結(jié)果顯示rSS1GFP感染雞后可在雞的不同組織器官中有效復(fù)制，尤其以脾、胸腺、法氏囊和氣管中的病毒含量高；而rSS1GFP-M/NLSm感染雞后僅在雞的脾、氣管、胸腺和法氏囊中檢測到病毒，并且病毒含量低(P<0.001)(圖2)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變降低病毒在雞組織中的復(fù)制能力。

組別Group喉頭拭子Laryngeal swab泄殖腔拭子Cloacal swab第3天第5天第3天第5天rSS1GFP3.4±0.32.9±0.51.9±0.51.3±0.2rSS1GFP-M/NLSm-1.4±0.3-0.5±0.2PBS----

病毒滴度用log10EID50表示。-表示未檢測到

Virus titers in three groups were expressed as log10EID50. - indicates not detected

圖2 雞感染病毒后的組織病毒含量檢測Fig.2 Detection of virus titers in different tissues of experimental chickens

2.4 雞感染病毒后的免疫器官病理切片觀察

在雞感染病毒后的第5天，對雞的免疫器官(脾、胸腺、法氏囊)進行組織病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示雞感染rSS1GFP后脾出現(xiàn)多處壞死灶、淋巴細胞顯著減少以及大量的巨噬細胞浸潤；胸腺中有明顯的組織增生、壞死以及淋巴細胞減少，胸腺小體結(jié)構(gòu)被破壞；法氏囊中出現(xiàn)大面積的壞死，濾泡髓質(zhì)區(qū)淋巴細胞和網(wǎng)狀細胞數(shù)量明顯減少(圖3)。而雞感染rSS1GFP-M/NLSm后的脾、胸腺和法氏囊出現(xiàn)的病變與對照組相似，沒有明顯的病理學(xué)變化(圖3)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變降低病毒對雞免疫器官的損傷。

圖3 雞感染病毒后免疫器官組織病理學(xué)觀察 (200×)Fig.3 Microscopic lesions in the immune organs of experimental chickens (200×)

2.5 M蛋白在試驗雞免疫器官中的表達情況檢測

對試驗雞感染病毒后第5天的免疫器官(脾、胸腺、法氏囊)中NDV M蛋白表達情況進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示rSS1GFP M蛋白在感染雞的免疫器官中可大量表達，其中以胸腺中的表達量最高；而rSS1GFP-M/NLSm M蛋白在雞的免疫器官中表達量均低于rSS1GFP M蛋白(圖4)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變降低NDV M蛋白在雞免疫器官中的表達。

圖4 M蛋白在試驗雞免疫器官中的表達檢測Fig.4 The expression of M protein in the immune organs of experimental chickens

2.6 雞感染病毒后免疫器官中的細胞因子轉(zhuǎn)錄變化

通過熒光定量PCR方法檢測雞感染病毒后第5天免疫器官中相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)錄變化，結(jié)果顯示：雞感染病毒后的免疫器官中不同細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢基本一致，除IFN-α外，rSS1GFP感染所誘導(dǎo)的細胞因子轉(zhuǎn)錄能力均高于rSS1GFP-M/NLSm，其中IFN-λ在脾、胸腺和法氏囊中的轉(zhuǎn)錄量均為最高，IL-6的轉(zhuǎn)錄量次之；IFN-β和IL-1β在脾中的表達量高于胸腺和法氏囊，而IL-10在胸腺中的轉(zhuǎn)錄量高于脾和法氏囊(圖5)。以上結(jié)果說明M蛋白NLS突變降低了病毒誘導(dǎo)的雞免疫器官中細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 雞感染病毒后免疫器官中細胞因子的轉(zhuǎn)錄變化Fig.5 Transcription analysis of the cytokine genes in the immune organs of experimental chickens

3 討 論

近年來，許多研究表明病毒蛋白細胞核定位對病毒的復(fù)制過程具有重要作用。例如Mori等[11]拯救了核心蛋白NLS突變的日本乙型腦炎病毒，與野生型病毒相比，突變型病毒由于抑制細胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯能力下降，導(dǎo)致在細胞內(nèi)的復(fù)制增殖能力顯著降低。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒NP蛋白細胞核定位可抑制宿主細胞的抗病毒免疫應(yīng)答以及促進病毒在細胞內(nèi)的有效復(fù)制。最近Rowe等[13]研究證實狂犬病病毒P蛋白在細胞核中能抑制宿主細胞基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平，干擾細胞抗病毒信號通路，從而促進病毒的復(fù)制。因此，病毒如何劫持和利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯和免疫系統(tǒng)，促進病毒的復(fù)制和致病進程逐漸成為國內(nèi)外研究熱點。

副黏病毒是一類對人和動物高度致病的、含有囊膜和單股負鏈不分節(jié)段基因組的RNA病毒，其M蛋白也被證實是一種多功能病毒蛋白。目前，對副黏病毒成員的呼吸道合胞體病毒和麻疹病毒M蛋白細胞核定位的功能研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，M蛋白在細胞核中主要有兩個方面的作用：一是抑制宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，促進病毒自身基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；二是在病毒感染早期保證病毒基因組在細胞質(zhì)中的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄達到一定水平，才指導(dǎo)M蛋白進入細胞質(zhì)進行子代病毒粒子的組裝和釋放。本課題組前期在拯救M蛋白NLS突變體NDV時，需要將收獲的雞胚尿囊液在SPF雞胚上盲傳3代才出現(xiàn)HA效價；與親本病毒rSS1GFP相比，突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm的毒力和空斑形成能力大大減弱，并且在雞胚成纖維細胞中的復(fù)制效率和產(chǎn)生細胞病變能力明顯降低[5]，說明M蛋白NLS突變極大地影響了NDV的復(fù)制增殖能力。本研究中，M蛋白NLS突變體病毒感染SPF雞后在雞喉頭和泄殖腔排毒量明顯減少，致病時間延遲且引起的死亡率顯著降低，同時造成的免疫器官組織病變明顯減輕，說明M蛋白NLS突變引起的NDV復(fù)制增殖能力減弱可以明顯降低NDV的致病力。另外，Duan等[16]前期拯救了M蛋白R42A突變體NDV，發(fā)現(xiàn)該病毒的M蛋白不能定位在細胞核，并且僅能在雞的肺和免疫器官中少量復(fù)制。在本研究中， M蛋白NLS突變體病毒感染SPF雞后僅在雞的氣管和免疫器官中復(fù)制且病毒滴度低，這與Duan等[16]的研究結(jié)果相符，其原因可能是NDV具有組織嗜性[17-18]，雖然M蛋白突變降低了NDV的復(fù)制增殖能力，但是突變體病毒感染雞后仍然能在免疫器官中少量復(fù)制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)M蛋白NLS突變體病毒感染雞后的第7—42天均未能檢測到NDV抗體，這與以往的研究結(jié)果均不同，原因可能與病毒在免疫器官中的復(fù)制能力大大減弱且病毒滴度低有關(guān)，未能達到刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體的病毒滴度。

有研究表明，除了病毒的復(fù)制效率對病毒致病性有重要影響外，病毒感染誘發(fā)的宿主免疫應(yīng)答對病毒的致病性也有重要作用[19]。本研究對雞分別感染親本病毒rSS1GFP和突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm后脾、胸腺和法氏囊中相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)錄情況進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本病毒感染組的免疫器官中除IFN-α外，IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β和IFN-λ的轉(zhuǎn)錄水平均高于突變體病毒感染組。Nakamura等[20]研究發(fā)現(xiàn)NDV感染雞后造成的過度免疫應(yīng)答會對宿主自身細胞造成損傷，加劇炎癥反應(yīng)，進而加速雞的死亡。筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本病毒感染雞后在免疫器官中具有高復(fù)制效率，并且上調(diào)了免疫器官中IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β和IFN-λ的轉(zhuǎn)錄水平，誘發(fā)的細胞強烈炎性應(yīng)答造成了免疫器官的嚴(yán)重損傷。相比之下，突變體病毒感染雞后在免疫器官中復(fù)制效率低且誘發(fā)的免疫應(yīng)答弱，所以造成的病理變化輕微。本研究與多個已發(fā)表的研究結(jié)果相一致[21-23]，即：NDV在免疫器官中誘發(fā)的強烈免疫應(yīng)答與病毒的致病性和病理變化保持一致。

在M蛋白NLS突變引起副黏病毒復(fù)制能力和致病性下降的機制研究方面，Pentecost等[24]拯救了M蛋白NLS突變的重組仙臺病毒和腮腺炎病毒，通過鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與病毒增殖和致病相關(guān)的細胞核蛋白和核仁蛋白發(fā)生了變化，這是導(dǎo)致突變體病毒復(fù)制和致病力下降的原因。綜合國內(nèi)外對副黏病毒M蛋白細胞核定位的功能研究，筆者推測M蛋白NLS突變導(dǎo)致的NDV復(fù)制和致病力降低可能與NDV基因組在細胞中的轉(zhuǎn)錄水平下降有關(guān)，因為突變體NDV在雞免疫器官中的M蛋白表達量發(fā)生了顯著降低；另外M蛋白NLS突變還可能會影響病毒感染后期子代病毒粒子的裝配和釋放，但是以上推測還需要更多的研究來證實。總之，本試驗確定了M蛋白NLS突變可明顯降低NDV的致病性，這為下一步開展M蛋白NLS突變對NDV基因組復(fù)制轉(zhuǎn)錄、病毒裝配和出芽的影響，篩選和分析M蛋白NLS突變型和野生型NDV感染細胞的差異表達蛋白，闡明M蛋白NLS突變影響NDV復(fù)制和致病的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

M蛋白NLS突變可明顯減弱NDV對SPF雞的致病性，減少病毒在雞喉頭和泄殖腔的排毒量，降低病毒在雞組織器官中的復(fù)制能力和對雞免疫器官的病理損傷，以及降低免疫器官中M蛋白的表達量和細胞因子的表達水平。