郭 承，萬 潔，楊應(yīng)東，文建國，劉俞辰，古小彬，謝 躍，楊光友*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130； 2. 攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，攀枝花 617061)

腦多頭蚴(Coenuruscerebralis)是多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)的中絳期幼蟲，常寄生于山羊、綿羊、牛等偶蹄類草食動物的腦和脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及皮下、肌間等部位[1-2]。腦多頭蚴病主要引起宿主腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙[3]。該病常見于非洲、東南亞等經(jīng)濟欠發(fā)達的發(fā)展中國家，給草食動物養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。在我國，以西北、華北、東北等廣大牧區(qū)及南方農(nóng)牧區(qū)最為多見[6]。此外，人也可偶然感染該病，在歐洲、非洲、巴西、以色列和美國等國家和地區(qū)已有相關(guān)報道[7-9]。腦包蟲病的治療通常包括藥物治療和手術(shù)治療，發(fā)病后期用藥物治療常效果不佳，而手術(shù)治療成本較高[6]。因此，開發(fā)新的防控技術(shù)對進一步搞好牛、羊腦多頭蚴病的防控具有十分重要的意義。

近年來，多頭帶絳蟲抗原基因的研究更多集中在診斷抗原的篩選上[2, 10-14]，而對于疫苗候選抗原的研究卻十分有限[15-21]。本試驗通過原核表達多頭帶絳蟲的Tm16基因和Tm-GST基因，用獲得的重組Tm16蛋白和重組Tm-GST蛋白對山羊進行免疫，評價其免疫保護效果，旨在為牛、羊腦多頭蚴病疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

44只3～4月齡攀枝花本地黑山羊(雌、雄各半)，由攀枝花農(nóng)林科學(xué)研究院提供。試驗前1個月全部羊免疫小反芻獸疫苗，使用伊維菌素和丙硫咪唑進行試驗前驅(qū)蟲處理。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試驗菌株EscherichiacoliBL21-pET32a(+)-rTm16[22]和BL21-pET32a(+)-rTm-GST[2]由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供。

1.2.2 主要試劑 蛋白Marker購自Fermentas公司；HRP標記兔抗山羊IgG購自武漢博士德公司；IPTG、Quil A(皂素)購自Sigma公司；Bio-Scale Mini Profinity Ni-charged IMAC預(yù)裝柱購自Bio-Rad公司；96孔酶標板購自Corning公司；麥芽糖購自成都市科龍化工試劑廠；BCA試劑盒購自上海貝博生物公司。

1.2.3 主要儀器 NGCTM10中高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad USA)；LyoQuest冷凍干燥機(Telstar Spain)。

1.3 rTm16與rTm-GST蛋白的表達與純化

取E.coliBL21-pET32a(+)-rTm16/BL21-pET32a(+)-rTm-GST表達菌株分別接種到含50 μg·mL-1Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)6 h直至菌液OD值達到0.6，再加入1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達6 h。隨后使用NGCTM10中高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)對所表達的重組蛋白進行純化，將收集得到的蛋白進行超濾，并用SDS-PAGE鑒定。使用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。

1.4 重組蛋白的保存

參照Gauci等[17]的方法，將純化后的重組蛋白混以皂素Quil A(Superfos, Denmark)，使用麥芽糖作為凍干保護劑進行凍干保存。

1.5 動物免疫試驗及免疫評價

1.5.1 試驗分組 試驗分組見表1。

表1試驗動物分組

Table1Groupsofexperimentanimals

試驗分組Groups數(shù)量/只Numbers每只動物免疫劑量Dosage per goatrTm16組1050 μg rTm16+1 mg Quil ArTm-GST組1150 μg rTm-GST+1 mg Quil ArTm16+1350 μg rTm16+50 μg rTm-rTm-GST組GST+1 mg Quil A皂素組101 mg Quil A

1.5.2 疫苗稀釋 使用無菌生理鹽水稀釋rTm16/rTm-GST/rTm16+rTm-GST疫苗以及皂素，稀釋后單疫苗組蛋白質(zhì)量濃度為25 μg·mL-1，聯(lián)合免疫組蛋白質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1，注射劑量為2 mL·只-1。

1.5.3 免疫程序 采用頸部皮下注射。借鑒綿羊包蟲病Eg95基因工程疫苗免疫程序，稍作調(diào)整，首免后1個月進行二次免疫，首免后7個月進行第三次免疫[23]。

1.5.4 采血 免疫前、后定期對各組山羊進行頸部靜脈采血，分離血清后保存于-20 ℃冰箱。

1.5.5 人工感染 第三次免疫2周后，全部試驗山羊按照約5 500 枚·只-1的量，口服攻擊多頭帶絳蟲活蟲卵(蟲卵由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供)。

1.5.6 剖檢計數(shù) 人工感染105 d(約3.5月)，試驗組山羊全部進行剖檢，記錄每只山羊腦部、肌間組織內(nèi)腦多頭蚴包囊的數(shù)量和大小。

1.5.7 血清抗體的間接ELISA檢測 采用間接ELISA方法，使用rTm16、 rTm-GST分別作為檢測抗原對各免疫組山羊血清進行特異性IgG抗體檢測(聯(lián)合免疫組使用rTm16和rTm-GST分別進行檢測)。

1.5.8 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)免疫組山羊與對照組山羊荷囊差異，統(tǒng)計出減囊率。公式如下：

應(yīng)用The Mann-Whitney U test進行各疫苗組相對于對照組的保護效果評價[17]。同時使用SPSS 20.0對各試驗組感染腦多頭蚴包囊數(shù)量、各組特異性抗體OD450 nm值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2. 1 重組蛋白疫苗的制備和純化

E.coliBL21-pET32a(+)-rTm16和E.coliBL21-pET32a(+)-rTm-GST經(jīng)1 mmol·L-1IPTG在37 ℃誘導(dǎo)6 h后，分別得到約30和41 ku的可溶性蛋白，并且蛋白穩(wěn)定(注：pET32a(+)的His標簽約18 ku)，表明成功表達出重組rTm16蛋白和重組rTm-GST蛋白。對所表達的重組蛋白通過Ni-NTA親和層析柱純化，結(jié)果顯示條帶單一，純度較好，見圖1。

對rTm16蛋白、rTm-GST蛋白以及rTm16+rTm-GST蛋白進行凍干處理，結(jié)果獲得淡黃色固體。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. 純化后的rTm16蛋白；2. 純化后的rTm-GST蛋白M. Protein marker; 1. The purified recombinant rTm16; 2. The purified recombinant rTm-GST圖1 重組蛋白rTm16和rTm-GST純化圖Fig.1 The purification of recombinant proteins rTm16 and rTm-GST

2.2 免疫保護試驗

2.2.1 人工感染 rTm-GST疫苗組和皂素對照組在口服攻擊多頭帶絳蟲的蟲卵后1～2周，分別有1、3只羊死亡(表2)，剖檢發(fā)現(xiàn)腦組織有腦炎病變，同時，死前伴有體溫升高、厭食、精神萎靡等腦膜腦炎癥狀。經(jīng)口感染多頭帶絳蟲的蟲卵后105 d(約3.5個月)，各組山羊全部進行剖檢，對照組全部發(fā)現(xiàn)有包囊存在，疫苗組腦多頭蚴包囊感染情況見表2。由表2可知，腦多頭蚴包囊在皂素對照組中全部位于山羊的腦和脊髓部，平均直徑約3 cm，而聯(lián)合免疫組包囊全部位于肌肉組織間，平均直徑約1.5 cm。相較于聯(lián)合疫苗組，rTm16疫苗組和rTm-GST疫苗組山羊在腦、脊髓和肌間組織部位均有包囊分布，其中有36%(4/11)的包囊位于肌間組織。通過計算減囊率，聯(lián)合免疫rTm16與rTm-GST的山羊獲得最大的減囊率(87.5%)，而注射rTm16疫苗、rTm-GST疫苗的山羊分別獲得50%、62.5%的減囊率。與對照組相比，rTm16與rTm-GST的聯(lián)合免疫顯著地提高了試驗山羊?qū)Χ囝^帶絳蟲蟲卵的抵抗能力(P=0.005)，而單獨使用rTm16或rTm-GST則差異不顯著(P=0.172；P=0.06)。

表2各組山羊感染腦多頭蚴包囊數(shù)量情況

Table2NumbersofCoenuruscerebralisofgoatsineachgroup

組別Groups個體感染包囊數(shù)量bCysts number不同部位包囊數(shù)量Cysts numberin tissues腦、脊髓CNS肌間Intramuscular tissues平均荷囊數(shù)/個Mean cysts number減囊率/%Cysts reduction rateP值aP valuerTm16組0,0,0,0,0,1,1,1,1,2330.6050.00.172rTm-GST組0,0,0,0,0,0,0,0,1,1,3410.4562.50.060rTm16+rTm-GST組0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,1020.1587.50.005對照組0,0,0,1,1,1,2,2,2,31201.20--

a.The Mann-WhitneyUtest被用于檢驗接種山羊相對于對照組山羊包囊數(shù)量的差異性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著；b.黑色加粗數(shù)字表示攻蟲以后死亡的山羊

a.The Mann-WhitneyUtest was used for comparison of the number of cysts in vaccinated goats compared with controls.P<0.05 means significant difference between the controls,P< 0.01 means that the difference is very significant between the controls;b.Black bold numbers mean the dead goats post challenge

2.2.2 血清特異性抗體的間接ELISA檢測 使用rTm16與rTm-GST蛋白分別作為檢測抗原，采用間接ELISA方法進行血清特異性IgG的檢測，各組血清IgG的OD450 nm值變化見圖2。從圖2可以看出，首免后，rTm-GST組、rTm16組、聯(lián)合免疫組山羊血清IgG值有明顯上升，進行二次免疫后各組山羊IgG達到最高，隨后緩慢下降，但仍高于臨界值。二免后半年進行三免，各免疫組特異性IgG迅速上升，其中rTm-GST疫苗組上升最明顯。

整個試驗期間，除去32周所檢測值外，由rTm-GST所誘導(dǎo)的rTm-GST疫苗組特異性IgG水平均低于由rTm16誘導(dǎo)的rTm16疫苗組的IgG水平且在攻蟲前具有顯著差異(P<0.05)；聯(lián)合免疫組中rTm16抗體水平高于rTm-GST的抗體水平，僅在第4、12、14周差異顯著(P=0.14；P=0.01；P=0.08)。隨著試驗的推進，rTm16疫苗組山羊的特異性IgG變化情況相比rTm-GST疫苗組更大。同時，在蟲卵攻擊以前，注射rTm-GST疫苗所誘導(dǎo)的血清抗rTm-GST-IgG水平均低于聯(lián)合免疫(rTm16和rTm-GST蛋白)時所誘導(dǎo)的抗rTm-GST-IgG水平，普遍呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，攻蟲以后，兩組山羊的抗rTm-GST-IgG水平差異不明顯(P>0.05)；而由rTm16蛋白所誘導(dǎo)的抗rTm16-IgG水平在單疫苗組和聯(lián)合免疫組之間差異不明顯(P>0.05)，這些結(jié)果表明，rTm16與rTm-GST聯(lián)合使用時對山羊抗rTm-GST-IgG的誘導(dǎo)可能產(chǎn)生了協(xié)同作用。

實線表示rTm16蛋白測定的臨界值，虛線表示rTm-GST蛋白測定的臨界值；* 表示聯(lián)合免疫組中，抗rTm-GST-IgG水平與抗rTm16-IgG水平呈現(xiàn)顯著差異；V1、V2、V3分別表示第一次免疫，第二次免疫和第三次免疫The real line means the cut-off value for the determination of rTm16 protein, the dotted line represents the cut-off value for rTm-GST protein. Asterisk (*) means that there was a significant difference in anti rTm-GST-IgG level and anti rTm16-IgG level in rTm16 and rTm-GST vaccine group. V1, V2, and V3 indicate that the first immunization, the second immunization and the third immunization, respectively圖2 各疫苗組山羊的血清特異性IgG OD450 nm值Fig.2 Serum specific IgG OD450 nm values of each vaccine group goat

3 討 論

3.1研究者最初發(fā)現(xiàn)六鉤蚴的代謝產(chǎn)物具有較好的抗多頭帶絳蟲感染的免疫效果[24]，使用多頭帶絳蟲六鉤蚴的代謝產(chǎn)物接種綿羊進行免疫保護試驗，免疫組綿羊獲得了75%的保護率[25]。隨著帶科絳蟲相關(guān)保護性抗原的相繼發(fā)現(xiàn)，針對帶科絳蟲中間宿主的保護性疫苗也得到了相應(yīng)的發(fā)展[26]。在這之中，不乏有抗原被成功制備成商業(yè)化疫苗[27-29]。帶科絳蟲16 kDa抗原基因最早是從羊帶絳蟲的六鉤蚴cDNA文庫篩選得到，是一類分泌抗原，國內(nèi)外學(xué)者已對部分帶科絳蟲的16 kDa抗原進行了研究，證實其具有較好的免疫原性而可用作疫苗抗原分子，Tm16與羊帶絳蟲(Taeniaovis)To16基因同源，研究已顯示該抗原能引起綿羊產(chǎn)生較高免疫力而抵抗多頭帶絳蟲的感染[17, 30]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)廣泛存在于各種生物體內(nèi)，具有抗氧化和解毒等重要作用，同時，該蛋白作為WHO提出的幾個最具潛力的候選疫苗分子之一，在保護宿主抵抗寄生蟲攻擊過程中也具有重要作用[31-32]。已有研究表明，日本血吸蟲、細粒棘球絳蟲和原蟲等多種寄生蟲的GST能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定水平的免疫力[33-36]。與此同時，多頭帶絳蟲的GST已成功應(yīng)用于山羊腦多頭蚴病的臨床診斷[2]。

在多頭帶絳蟲疫苗抗原的研究中，Gauci等[17]首次擴增出多頭帶絳蟲16 K基因與18 K基因，并分別構(gòu)建了帶有GST標簽的表達載體，并用表達出的蛋白進行了免疫保護試驗，單蛋白免疫組綿羊按每只50 μg蛋白、聯(lián)合免疫組rTm16與rTm18各50 μg，分別配以1 mg Quil A佐劑的劑量對綿羊進行三次免疫，各次免疫間隔兩周；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tm16組和Tm16+Tm18組綿羊的包囊數(shù)量(分別為6個和11個)與對照組(34個包囊)相比均差異顯著(P=0.023；P=0.015)，且兩組綿羊無一死亡，誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的免疫保護力。在此基礎(chǔ)上，Varcasia等[37]對意大利六個農(nóng)場共計632只綿羊進行田間試驗，其中208只作為免疫組分別皮下注射Tm18重組蛋白50 μg并配以1 mg皂素佐劑，1個月后進行第二次免疫，免疫后的40個月時間里，僅一只羊發(fā)病，與對照組32只羊發(fā)病呈極顯著差異(X2= 14.08，P< 0.001)。此外，張壯志等[15]使用福氏佐劑乳化的多頭帶絳蟲重組45M蛋白對免疫組6只綿羊進行注射，共免疫四次，每次間隔3周，結(jié)果免疫組綿羊減囊率約70%。

而本試驗通過原核表達獲得了帶His標簽的重組rTm16和rTm-GST，配以皂素為佐劑免疫山羊，末次免疫后2周進行活蟲卵感染。多頭帶絳蟲感染常會引起宿主死亡，疫苗組除rTm-GST組中有1只羊死亡，其余各組山羊均存活。而對照組中三只羊于攻蟲后1～2周死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)腦部有局部炎癥，同時有充血現(xiàn)象，因此其死亡原因應(yīng)為六鉤蚴移行引起的急性死亡。從各組剖檢情況來看，疫苗組包囊平均大小均小于對照組，反映出rTm16或rTm-GST能對山羊產(chǎn)生一定保護作用。從最終數(shù)據(jù)分析來看rTm16組、rTm-GST組、rTm16+rTm-GST組山羊均獲得50%以上減囊率，其中rTm16+rTm-GST組減囊率達到87.5%，且高于rTm45M蛋白對綿羊免疫保護的結(jié)果[17]。研究結(jié)果表明：rTm16、rTm-GST以及rTm16+rTm-GST蛋白均能誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生一定的保護力，但采用rTm16+rTm-GST的聯(lián)合免疫方式更有效。

3.2Gauci等[17]研究中各組綿羊由Tm16所誘導(dǎo)的特異性抗體效價始終高于Tm18所誘導(dǎo)的抗體效價，Tm16組與Tm16+Tm18組綿羊均獲得了顯著的保護力(P分別為0.023與0.015)，并且rTm18特異性抗體水平并沒有因為兩種重組蛋白的聯(lián)合免疫而得到提高。本試驗在攻蟲以前，各時間點所測rTm16組IgG水平均高于rTm-GST組并具有顯著性差異，但rTm16組并未獲得顯著的免疫保護力(P=0.172)；而聯(lián)合免疫組中，雖然由rTm16誘導(dǎo)的IgG水平仍高于由rTm-GST誘導(dǎo)的IgG水平，但只在部分觀測點(4、12、14周)具有顯著性差異，與此同時，聯(lián)合免疫rTm16和rTm-GST蛋白引起了高于單獨注射rTm-GST蛋白所誘導(dǎo)的血清抗rTm-GST-IgG值，該組山羊也獲得了極顯著的保護效力(P=0.005)。這表明rTm16與rTm-GST之間可能存在協(xié)同效應(yīng)而誘導(dǎo)了更高的特異性抗體水平。

4 結(jié) 論

rTm16、rTm-GST單疫苗組按50 μg·2 mL-1，聯(lián)合疫苗組按100 μg·2 mL-1(rTm16與rTm-GST各50 μg)的免疫劑量，分別配以1 mg皂素佐劑對山羊皮下免疫3次(首免后1個月進行二免，二免后6個月進行三免)，三免后2周攻蟲。免疫保護結(jié)果為rTm16組、rTm-GST組、rTm16+rTm-GST組山羊分別獲得了50%、62.5%和87.5%的減囊率，其中rTm16+rTm-GST組山羊保護效果最好(P=0.005)。與此同時，rTm16與rTm-GST的聯(lián)合使用能誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生更高的抗rTm-GST-IgG水平，表明rTm16與rTm-GST之間可能存在某種協(xié)同效應(yīng)。