■宋獻(xiàn)藝 劉 洋 周勝花

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，山西太原030000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032)

抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)中的廣泛使用，能夠提高動(dòng)物生長性能，提高動(dòng)物抗病能力，但是，抗生素在動(dòng)物機(jī)體殘留，污染環(huán)境等嚴(yán)重問題日益突出[1]，禁抗的趨勢亟不可待，開發(fā)替抗產(chǎn)品是時(shí)代所需。益生菌具有能夠提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率、生長性能、免疫力、降低腹瀉率等優(yōu)點(diǎn)[2-5]，因此是一種重要的替代抗生素產(chǎn)品。益生菌的來源有很多種，可以通過體外試驗(yàn)篩選同源益生菌及其復(fù)合物。Liu等[6]研究表明，添加干酪乳桿菌和腸球菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高斷奶仔豬生長性能和免疫能力，維持腸道平衡，降低死亡率和腹瀉率。J?rgensen等[7]研究表明，添加400 mg/kg芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）能夠提高斷奶仔豬生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。Deng等[8]研究表明，枯草芽孢桿菌RJGP16和唾液乳桿菌B1具有協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)腸道免疫力。仇武松等[9]研究表明，添加產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌均能提高湖羊飼料轉(zhuǎn)化效率并可提高蛋白質(zhì)消化率，枯草芽孢桿菌的效果明顯優(yōu)于產(chǎn)朊假絲酵母。但Tanja等[10]研究表明，添加乳酸菌對(duì)生長性能和腸道形態(tài)并沒有顯著影響。目前關(guān)于益生菌制劑的應(yīng)用以單一菌種研究為主，多種益生菌聯(lián)合對(duì)動(dòng)物的研究相對(duì)較少，本試驗(yàn)旨在研究復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響，為復(fù)合益生菌制劑的開發(fā)與利用提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)公司；MRS液體培養(yǎng)基、生化鑒定所用全部試劑均為青島海博生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、膠回收試劑盒等為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地選擇6頭斷奶后1周（28日齡）的飼料中沒有添加抗生素的健康仔豬。

1.3 復(fù)合益生菌制劑

復(fù)合益生菌制劑為本課題組自行研發(fā)，內(nèi)含乳酸菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母，總有效活菌數(shù)大于1010cfu/g。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)

選用28日齡斷奶健康杜×長×大三元仔豬80頭（由山西廣聯(lián)畜禽有限公司種豬場提供），隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭豬，分別添加0.1%復(fù)合益生菌制劑的試驗(yàn)組和基礎(chǔ)日糧對(duì)照組。試驗(yàn)進(jìn)行28 d。

1.5 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

基礎(chǔ)日糧為玉米-豆粕型為基礎(chǔ)日糧，粉料，營養(yǎng)需要參照山西廣聯(lián)畜禽飼料有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/140000SXGL01-2013設(shè)計(jì)，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.6 飼喂管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在山西廣聯(lián)畜禽有限公司種豬場進(jìn)行，每天8:00、13:00、19:00飼喂豬群，自由飲水，每次飼喂直至料槽剩余少許飼料為止，并記錄采食量，按常規(guī)免疫程序接種和飼養(yǎng)管理。

1.7 測定指標(biāo)

1.7.1 菌體形態(tài)學(xué)檢查

純培養(yǎng)后直接觀察其菌落形態(tài)，然后并進(jìn)行革蘭氏染色和孔雀綠染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌菌體形態(tài)。

1.7.2 16S rRNA序列分析

分離的每株菌采用珠磨法[8]提取總DNA。培養(yǎng)液0.2 ml與1 ml TN150（Tris-NaCl buffer）和150 μl水飽和酚混合，在珠磨儀（Mini-Bead Beater，Biospec，USA）上5 000 r/min珠磨3 min破碎樣品。經(jīng)三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris]飽和酚和氯仿/異戊醇反復(fù)抽提，用乙醇沉淀DNA，適量TE緩沖液（Tris-EDTA buffer）溶解DNA沉淀。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

以細(xì)菌通用引物8f[5'CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG]和1510r[5'GTG AAG CTTACG G(C/F)T ACC TTG CGA CTT]（Invitrogen公司合成）擴(kuò)增每株細(xì)菌16S rRNA基因全序列（Zoetendal等，1998）。反應(yīng)體系為：10×緩沖液，5 μl；dNTP（10 mmol/l），1 μl；MgCl2（25 mmol/l），4 μl；Taq DNA聚合酶（5 U/μl），0.8 μl；1 μl模板（1～10 ng/ml），上下游引物（10 μmol/l）各1 μl；加無菌雙蒸水至50 μl。PCR反應(yīng)條件如下：94℃，3 min預(yù)變性；94℃，45 sec；58 ℃，45 sec；68 ℃，90 sec，循環(huán)35次；68 ℃，7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)Wizard SV Gel和PCR Clean-Up system(Promega，USA)純化后，插入pGEM-T載體（美國，Promega）并轉(zhuǎn)化入E.coli Top10，再以克隆的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以檢測插入子的大?。╓right和Pimm，2003）。插入正確的陽性克隆分別用HhaⅠ、BsaⅠ等限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

形態(tài)、生化試驗(yàn)和酶切圖譜完全一樣的作為一個(gè)OTU。在每個(gè)OTU中選擇一個(gè)單克隆用引物SP6、T7進(jìn)行測序（Invitrogen，上海）。將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。

1.7.3 生長性能指標(biāo)

分別于試驗(yàn)的開始和結(jié)束時(shí)對(duì)仔豬進(jìn)行空腹稱重，根據(jù)各組仔豬始末體重，計(jì)算平均日增重。每日觀察試驗(yàn)仔豬生長健康狀態(tài)，記錄腹瀉豬只頭數(shù)、各欄日糧消耗量、死亡仔豬頭數(shù)，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料肉比和腹瀉率。

腹瀉率(%)=總腹瀉次數(shù)/(總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100

1.7.4 營養(yǎng)物質(zhì)消化率

采用全收糞法在試驗(yàn)開始后的第21～25 d進(jìn)行為期5 d的消化試驗(yàn)。糞樣烘干后粉碎過40目篩，放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。測定試驗(yàn)日糧和糞樣的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、總能及粗灰分含量，從而計(jì)算其消化率。

1.7.5 經(jīng)濟(jì)效益分析

通過調(diào)查每頭豬的增重收入及飼養(yǎng)成本，記算平均毛利。比較試驗(yàn)組與對(duì)照組仔豬的平均毛利，從而對(duì)經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.3進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。各組數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 益生菌菌株的分離、鑒定

從斷奶仔豬直腸中共分離出3個(gè)菌株，分別命名為B1、C1和S1，見表2。由表2可見，B1和C1分離自MRS培養(yǎng)基，為乳酸菌，C1為球菌，B1均為桿菌；S1分離自營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，為芽孢桿菌。

表2 分離菌株的形態(tài)學(xué)結(jié)果

分離菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的BLAST結(jié)果見表3。結(jié)果表明：B1為德氏乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii），C1為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），S1為枯草芽孢桿菌分離種C9-1（Bacillus subtilis isolateC9-1）。

2.2 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響(見表4)

表4可見，試驗(yàn)組和對(duì)照組平均日采食量差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)組與對(duì)照組相比平均末重和平均日增重差異顯著（P＜0.05），添加益生菌制劑比對(duì)照組平均日增重提高了20.72%；在料肉比方面，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別為1.56和1.78，添加復(fù)合益生菌制劑比基礎(chǔ)日糧組料重比降低了12.36%，差異顯著（P＜0.05）；由此可見，飼料中添加復(fù)合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬的生長性能。

表3 分離菌16S rRNA基因BLAST結(jié)果

表4 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

2.3 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影晌

表5可見，雖然試驗(yàn)組腹瀉率和腹瀉指數(shù)較對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，但試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，腹瀉率下降了22.73%，腹瀉指數(shù)也有所下降，證明飼料中添加復(fù)合益生菌制劑可以在一定程度上降低斷奶仔豬的腹瀉率。

表5 復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響

2.4 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響見表6，添加復(fù)合益生菌制劑的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，粗蛋白、有機(jī)物、干物質(zhì)和總能消化率均有提高，其中總能、有機(jī)物分別提高了2.99%和4.15%，但差異不顯著(P＞0.05)；粗蛋白和干物質(zhì)分別提高5.70%和2.81%，差異顯著(P＜0.05)?？梢?，復(fù)合益生菌制劑可在一定程度上提高仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，從而提高飼料利用率。

表6 復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響(%)

2.5 經(jīng)濟(jì)效益分析

在水電、人工、管理等費(fèi)用不計(jì)算在內(nèi)的前提下，由表7知，對(duì)照組平均每頭豬可獲毛利36.42元，試驗(yàn)組平均每頭豬可獲毛利49.39元，平均每頭豬試驗(yàn)組比對(duì)照組多獲利12.97元，經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。

表7 復(fù)合益生菌制劑對(duì)仔豬生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益分析

3 討論

3.1 益生菌菌株的分離、鑒定

動(dòng)物消化道微生物具有多樣性和特異性，寄主和腸道菌之間存在著相互選擇、相互依賴的關(guān)系[10]。本試驗(yàn)從斷奶仔豬消化道分離的2株乳酸菌和1株芽孢桿菌，來源于消化道，更容易適應(yīng)腸道環(huán)境，從而能更好地在仔豬體內(nèi)定植發(fā)揮益生作用。

3.2 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

一般情況下，動(dòng)物消化道內(nèi)含有大量的有益微生物用來維持消化道的菌群平衡，但斷奶仔豬腸道發(fā)育不成熟，因此，大量研究表明，添加益生菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高其生長性能，提高仔豬免疫力和腸道微生物數(shù)量[6，11-13]。辛娜等[14]研究結(jié)果表明，飼喂芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬的平均日增重及飼料轉(zhuǎn)化率均沒有影響。Rolfe[15]研究表明，復(fù)合菌比單一菌效果更好。本研究認(rèn)為飼料中添加復(fù)合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬的生長性能，這與前人的研究結(jié)果一致。

3.3 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響

規(guī)?；i場的不斷完善和發(fā)展，早期斷奶作為提高母豬生產(chǎn)力的重要措施之一，但同時(shí)早期斷奶仔豬腸道微生物群系受到破壞而產(chǎn)生應(yīng)激，有益菌減少，大腸桿菌等有害菌大量繁殖，容易引起仔豬腹瀉。黃金華等[16]研究表明，添加復(fù)合益生菌制劑(植物乳桿菌、嗜酸性乳桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、釀酒酵母)能夠顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。劉虎傳等[17]研究表明，添加益生菌(植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌)飼喂斷奶仔豬后能夠顯著降低腹瀉率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合益生菌制劑能夠顯著降低腹瀉率，這與前人的結(jié)果一致。

3.4 添加復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

益生菌在腸道內(nèi)發(fā)酵，能夠促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。黃金華等[16]研究表明，添加復(fù)合益生菌飼喂斷奶仔豬后能夠顯著提高日糧的總能、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、灰分、鈣、磷的消化率。Giang等[18]研究表明，添加乳酸菌復(fù)合菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高粗蛋白、粗纖維和有機(jī)物的回腸表觀消化率。本研究表明，能夠顯著提高粗蛋白和干物質(zhì)的消化率，對(duì)有機(jī)物和總能的消化率具有提高的趨勢，但差異不顯著。這與前人的結(jié)果尚存在一定的差異，這可能與日糧組成、環(huán)境、豬品種等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

添加復(fù)合益生菌制劑飼喂斷奶仔豬后能夠提高其生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率，降低腹瀉率，同時(shí)提高純收入，因此0.1%添加復(fù)合益生菌制劑應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)的前景十分廣闊。