管西芹，毛近隆，閆 濱，王丹丹，張欣欣，周洪雷

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性溫，味辛、甘，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血小板凝聚、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[1，2]。當(dāng)歸是最常用的中藥之一，具有“十方九歸”之譽，尤其臨床上作為補(bǔ)血活血藥在心腦血管系統(tǒng)中廣泛應(yīng)用。

心腦血管疾病與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，當(dāng)歸中的抗氧化物質(zhì)可降低機(jī)體的氧化損傷。研究報道，當(dāng)歸芍藥散[3]具有清除羥自由基、超氧陰離子的作用，明顯抑制腦過氧化脂質(zhì)的生成，顯著提高衰老小鼠和缺血/再灌損傷大鼠腦、血清中的SOD活力，降低血清中MDA的含量；當(dāng)歸補(bǔ)血湯[4]在大鼠心肌缺血模型中，明顯降低血清中TNF-α、IL-6和MDA的含量，提高血清中SOD、CAT和GPx的活力，顯著改善冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心臟病理學(xué)改變，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

當(dāng)歸中的抗氧化藥效物質(zhì)報道有酚酸類[5]、黃酮類[6]、當(dāng)歸多糖[7,8]以及當(dāng)歸內(nèi)酯[9,10]等。當(dāng)歸中有機(jī)酸類成分含量較多，中國藥典[11]規(guī)定當(dāng)歸中阿魏酸的含量不低于0.050%(也即0.5 mg/g)，在不同產(chǎn)地[12]當(dāng)歸中的阿魏酸為0.46～1.95 mg/g，在不同炮制[13]當(dāng)歸中的阿魏酸為0.12～0.75 mg/g。從生化途徑看，咖啡酸與阿魏酸都是由莽草酸通過系列反應(yīng)生成的肉桂酸衍生物[14]，當(dāng)歸中也有少量咖啡酸，但國內(nèi)研究鮮有報道。

1 實驗材料

當(dāng)歸(產(chǎn)地甘肅，批號161101)：山東百味堂中藥飲片有限公司生產(chǎn)，購于山東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，粉碎，過三號篩。按照《中國藥典》2015年版1部[11]測定當(dāng)歸中阿魏酸的含量為0.069%(也即0.69 mg/g)，符合藥典不少于0.050%的要求。

儀器與試劑：阿魏酸(上海詩丹徳公司；批號588)、咖啡酸(上海詩丹徳公司；批號2681)；DPPH(北京中生瑞泰科技有限公司；批號160506)，ABTS(上海阿拉丁生化科技股份有限公司；批號#K1517067)，維生素C(Vc)(上海源葉生物科技有限公司；批號160709)；乙腈為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；滬試)，乙醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；滬試)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。LC-10ATvp高效液相色譜儀(島津，日本)；SPD-10A檢測器(島津，日本)；ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)色譜柱(安捷倫，美國)；FA1004N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；QE-300高速萬能粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)公司)，Spectra Max多功能讀板機(jī)(美谷分子儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 當(dāng)歸提取液中阿魏酸與咖啡酸含量的測定

2.1.1 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)，流動相乙腈- 0.085%磷酸水溶液(17∶83)，檢測波長為316 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸對照品0.0019 g，咖啡酸0.0014 g，分別置10 mL容量瓶中，70%甲醇定容，即得對照品儲備液，移液槍分別移取對照品儲備液各200 μL置2 mL EP管，加入1600 μL 70%甲醇溶液制成每1 mL含阿魏酸19 μg和咖啡酸14 μg的混合對照品溶液，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

取0.5 g當(dāng)歸粉末，放入圓底燒瓶，加入50 mL蒸餾水，稱重記錄，加熱回流1 h，放冷，溶劑補(bǔ)足失重，混勻，即得當(dāng)歸水提液。同法，得到不同溶劑的當(dāng)歸提取液，提取溶劑分別為30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、酸水溶液(HCl調(diào)節(jié)pH為2～3)、堿水溶液(NaOH調(diào)節(jié)pH為11～12)，酸水與堿水提取液分別用NaOH和HCl將pH調(diào)至中性，移液槍移取200 μL當(dāng)歸提取液置2 mL EP管，加入1800 μL 70%甲醇溶液，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 含量測定

取步驟“2.1.3”所得供試品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，記錄保留時間與峰面積，外標(biāo)一點法計算阿魏酸與咖啡酸的含量(mg/g)，結(jié)果見表1。

線性關(guān)系考察：分別取19 μg/mL的阿魏酸標(biāo)對照品溶液和14 μg/mL的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 mL置10 mL容量瓶，70%甲醇定容，共得6個不同濃度的混合對照品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，以對照品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=56 489X+756.96，R2=0.999 3；咖啡酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=55 224X-1 645.6，R2=0.999 1。

精密度檢驗：取阿魏酸和咖啡酸混合對照品溶液，按擬定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄阿魏酸和咖啡酸的峰面積，計算兩組分峰面積的 RSD 分別為 0.3% 和 0.5%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取6份同一批次當(dāng)歸藥材粉末，精密稱定，按照“2.1.3”步驟用70%乙醇提取，按擬定的色譜條件進(jìn)樣分析。阿魏酸和咖啡酸含量的 RSD 分別為 0.9% 和1.5%。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8、10 h，按擬定的色譜條件進(jìn)樣分析。阿魏酸和咖啡酸峰面積的 RSD 分別為 1.7% 和 3%。結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率考察：取同一批次已知含量的當(dāng)歸粉末6份，加入已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，再加入70%乙醇溶液50 mL，按照“2.1.3”制備供試品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，計算加樣回收率。阿魏酸的加樣回收率為 98.3%，RSD為1.3%，咖啡酸的加樣回收率為 96.3%，RSD 為1.9%。

2.2 當(dāng)歸提取液抗氧化活性的研究

2.2.1 DPPH·自由基清除能力的研究

參考文獻(xiàn)[15]的方法，并稍作改進(jìn)。將當(dāng)歸不同溶劑的提取液稀釋成不同濃度的測試液，Vc作參照品。移液槍移取測試液50 μL置96孔板內(nèi)，設(shè)兩個副孔，再加入120 μg/mL的DPPH溶液100 μL，對照組用70%乙醇代替不同濃度的測試液，避光反應(yīng)30 min，用多功能讀板機(jī)在517 nm處測各孔的吸光度，分別記作A測試和A對照，按照下述公式計算清除率。

參考文 獻(xiàn)[15]的方法，并稍作改進(jìn)。用95%乙醇配制135 μg/mL的ABTS工作液，將當(dāng)歸提取液用乙醇稀釋成一系列不同濃度的測試液，Vc做參照品。移取50 μL不同濃度的提取液和100 μL ABTS工作液置96孔板內(nèi)，設(shè)兩個副孔，對照組用95%乙醇代替不同濃度的當(dāng)歸提取液，避光反應(yīng)6 min，用多功能讀板機(jī)在734 nm處測各孔的吸光度，分別記作A測試和A對照，計算公式與DPPH相同。

自由基清除能力以半數(shù)抑制率(IC50)來衡量，IC50是指清除率為50%時的藥物濃度(以每毫升測試溶液相當(dāng)于原藥材的質(zhì)量來表示)，IC50值越小其清除自由基的能力越強(qiáng)。IC50值以濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)做回歸方程來計算求得。

3 結(jié)果與分析

3.1 阿魏酸和咖啡酸的含量測定

按照“2.1.1”的色譜條件進(jìn)樣，檢測單一對照品、混合對照品及供試品溶液的色譜圖，通過比較有2個主要色譜峰(如圖1-A和圖1-B所示)，咖啡酸和阿魏酸的保留時間分別為4.046 min和8.873 min，按外標(biāo)一點法分別計算供試品中阿魏酸和咖啡酸的含量，結(jié)果如表1所示。將當(dāng)歸用70%甲醇提取時，阿魏酸的含量為0.690 mg/g，咖啡酸為0.039 mg/g，其中阿魏酸的含量與王婕等[12]報道相近；當(dāng)歸用純水提取時咖啡酸的含量為0.071 mg/g，與Li等[16]報道基本一致。

圖1 混合對照品溶液(A)和當(dāng)歸水提取液(B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference solution (A) and extract of water from Angelica (B)

當(dāng)歸以不同溶劑提取時，阿魏酸的含量為0.574～0.707 mg/g，咖啡酸的含量為0.012～0.082 mg/g，并呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，如圖2所示。當(dāng)歸以不同醇濃度的溶劑提取時，隨著乙醇濃度的增加，咖啡酸的溶出逐漸降低，從0.071 mg/g降低到0.012 mg/g；而阿魏酸的含量在30%乙醇時最高，從0.597 mg/g增加到0.652 mg/g，又逐漸降低至0.574 mg/g。當(dāng)歸以不同酸堿度的溶劑提取時，堿性條件下阿魏酸和咖啡酸的含量最高，分別為0.707 mg/g和0.082 mg/g，酸性條件下不利于咖啡酸但有利于阿魏酸的溶出。

表1 當(dāng)歸提取液中咖啡酸與阿魏酸的含量(n=3)Table 1 The content of Caffeic acid and Ferulic acid in Angelica extract(n=3)

圖2 不同溶劑對提取液中阿魏酸(FA)與咖啡酸(CA)含量的影響Fig.2 Effect of different solvents on the contents of ferulic acid (FA) and caffeic acid (CA) in extrects

圖3 不同提取液對DPPH·和自由基清除能力比較Fig.3 Comparison of scavenging activity on DPPH and free redical of different extrects注：a：酸水，b：堿水，c：純水，d：30%乙醇，e：50%乙醇，f：70%乙醇，g：95%乙醇。Note:a:Acid water,b:Alkaline water,c:Water,d:30% Ethanol,e:50% Ethanol,f:70% Ethanol,g:95% Ethanol.

3.2 當(dāng)歸提取液對DPPH·和自由基的清除能力

從圖3-C可以看出不同條件下的當(dāng)歸提取液對DPPH自由基都具有一定的清除作用，在堿水溶液提取時阿魏酸和咖啡酸的含量最高，清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，IC50值為5.373 mg/mL；在醇溶液提取時，清除DPPH自由基的能力隨乙醇濃度的增加，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢；在30%乙醇提取時活性最高，IC50值為5.641 mg/mL；純水或95%乙醇提取時的清除能力都較弱，其中95%乙醇時阿魏酸和咖啡酸的含量最低，清除DPPH自由基的能力最弱，其IC50值大于10 mg/mL。

4 討論

在反相色譜柱為ZORBAX SB-C18，乙腈-0.085%磷酸水溶液(17∶83)，檢測波長為316 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ℃條件下檢測，當(dāng)歸中兩種酚酸類物質(zhì)的HPLC保留時間比較，咖啡酸(4.046 min)較小，阿魏酸(8.873 min)較大，由于咖啡酸有2個酚羥基，其極性大而保留時間小。當(dāng)歸以不同的溶劑提取時，阿魏酸的含量為0.574～0.707 mg/g，咖啡酸為0.012～0.082 mg/g。當(dāng)歸用95%乙醇提取時，阿魏酸和咖啡酸的含量最低，分別為0.574 mg/g和0.012 mg/g；而堿水溶液有利于酚酸類物質(zhì)的水解和溶出，阿魏酸和咖啡酸的含量最高，分別為0.707 mg/g和0.082 mg/g。