張曉娟，徐德平

江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫214122

大麥芽(Barely malt)是禾本科一年生草本植物大麥(Barley)的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥而得，不但含有供人體基礎(chǔ)代謝所需的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，還含有對(duì)人體有特殊功能的酶類、酚類和黃酮類等生物活性物質(zhì)，具有健脾消食、促進(jìn)消化、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種功能[1，2]。乳腺增生是乳腺癌的前奏，其發(fā)病機(jī)制主要與體內(nèi)雌激素、孕激素和催乳素的比例失衡有關(guān)。其中，催乳素的含量增加是乳腺增生發(fā)病的重要原因。

大麥芽作為一種藥食同源的材料，還具有回乳的功能，其回乳是通過(guò)抑制PRL分泌來(lái)完成的[3，4]，目前認(rèn)為大麥芽具有抗乳腺增生作用也是通過(guò)抑制PRL分泌，但具體功能成分尚未明確。本研究利用多種色譜方法，從大麥芽活性部位分離出四種主要的活性成分，為實(shí)現(xiàn)大麥芽抑制PRL分泌和抗乳腺增生作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

大麥芽(江蘇農(nóng)墾大麥芽有限公司)；苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)100802)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)110403)；MCI柱、ODS柱、ODS-A柱(均為天津南開(kāi)大學(xué)化學(xué)工廠產(chǎn)品)；無(wú)水乙醇、醋酸鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、正丁醇、濃硫酸、茴香醛、乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；小鼠催乳素ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠(60只，雌性，6周齡，20～25 g)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RAT-100D雙層玻璃萃取罐(無(wú)錫申科儀器有限公司)；SYB106-100型恒流泵(天津市科器高新技術(shù)公司)；MP-201型真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)；W-O升降恒溫油水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)；HSGF254型薄層板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)；核磁共振儀(Avance 500 MHz，Bruer公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大麥芽不同萃取物的制備

稱取10 kg大麥芽，粉碎，加入100 L雙層玻璃萃取罐中，以料液比1∶8 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，于60 ℃條件下攪拌提取6 h，過(guò)濾取出上清液，濾渣再按上述方法提取2次，合并所有清液減壓濃縮。濃縮物按1∶1加入去離子水，超聲至懸濁狀，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓濃縮得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，于冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 不同萃取物對(duì)乳腺增生的作用

2.2.1 乳腺增生小鼠模型的建立

參考文獻(xiàn)方法[5,6]并加以改進(jìn)，正常對(duì)照組小鼠肌肉注射生理鹽水 0.1 mL/只，1次/天，連續(xù)注射30天。其余小鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，1次/天，連續(xù)25天，繼而改用肌肉注射黃體酮注射液5 mg/kg，1 次/天，連續(xù)5天。

2.2.2 分組及給藥

ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成6組(石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、萃余物組、模型組、正常對(duì)照組)，每組10只。除正常對(duì)照組小鼠外，其余小鼠均建立乳腺增生小鼠模型。

造模完成后，實(shí)驗(yàn)組分別灌胃石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物各500 mg/(kg·d)；正常對(duì)照組和模型組分別給予等量蒸餾水，1次/天，連續(xù)1個(gè)月。

2.2.3 血清激素的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫分析法，按照小鼠催乳素ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中的實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行，分別測(cè)定各組小鼠血清中PRL的含量。

2.3 乙酸乙酯萃取物的分離

將具有抑制PRL分泌的乙酸乙酯萃取物取出解凍，過(guò)濾，上MCI柱，依次用去離子水、體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)將具有相同成分的洗脫液合并，分別減壓濃縮得到A(50%)、B(70%)、C(90%)三個(gè)部分。

將A、B、C三個(gè)部分分別上ODS柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流速20 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)將具有相同成分的洗脫液合并，分別減壓濃縮得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別反復(fù)上ODS-A柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流速6 mL/min，洗脫液用15 mL/管自動(dòng)收集器收集，TLC法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)將具有相同成分的洗脫液合并，直至得到四個(gè)純化合物：1、2、3、4。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物，將得到的化合物經(jīng)氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 大麥芽不同萃取物抗PRL分泌的檢測(cè)結(jié)果

大麥芽不同萃取物對(duì)各組小鼠的血清PRL水平影響如表1所示。

組別Group血清PRL SerumPRL (pg/mL) 正常對(duì)照組Control214.06±11.37 ?模型組Model345.75±24.63石油醚組Petroleum ether extract336.24±15.76乙酸乙酯組Ethyl acetate extract243.13±13.84 ? ?正丁醇組n-Butyl alcohol extract296.34±23.75萃余物組Remaining extract351.33±13.47

注：與模型組比較:*P<0.01，**P<0.05。
Note:Compare with Model,*P<0.01，**P<0.05.

由表1的數(shù)據(jù)可以得出：模型組小鼠的血清PRL水平(P<0.01)明顯高于正常對(duì)照組的水平，說(shuō)明小鼠乳腺增生模型的制備是成功的[4，5]。與模型組比較，乙酸乙酯組小鼠的血清PRL水平明顯降低，差異顯著(P<0.05)。石油醚組、正丁醇組和萃余物組均無(wú)顯著變化。結(jié)果表明大麥芽乙酸乙酯萃取物具有明顯的抑制PRL分泌的作用，大麥芽石油醚萃取物、正丁醇萃取物和萃余物抑制PRL分泌的作用不明顯。

3.2 大麥芽抗PRL活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

從具有抗PRL活性的乙酸乙酯萃取物中分離到主要的4個(gè)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析如下:

化合物1無(wú)色脂狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:5.30 (1H,s),3.96 (2H,d,J=3.2 Hz),3.73 (2H,d,J=3.2 Hz),3.66(2H,d,J=2.8 Hz),3.55 (2H,d,J=2.8 Hz),3.13 (3H,s)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:172.8 (C-1),65.4 (C-2),65.1 (C-3),65.7 (C-4),68.2 (C-5),65.9 (C-6),53.1 (C-7)。從以上數(shù)據(jù)可推導(dǎo)出化合物1為一甘油酯類化合物。與相關(guān)文獻(xiàn)[7,8]對(duì)比可得化合物1為3-甲基-1-十六烯酸乙酯甘油酯。

化合物2無(wú)色脂狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:5.41 (1H,s),4.01 (2H,d,J=3.2 Hz),3.75 (2H,d,J=3.2 Hz),3.68 (2H,d,J=2.8 Hz),3.59 (2H,d,J=2.8 Hz),3.21 (3H,s)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:174.6 (C-1),65.9 (C-2),65.7 (C-3),65.4 (C-4),68.2 (C-5),65.1 (C-6),55.2 (C-7)。從以上數(shù)據(jù)可推導(dǎo)出化合物2為一甘油酯類化合物。與相關(guān)文獻(xiàn)[7,8]對(duì)比可得化合物2為3-甲基-1-十八烯酸乙酯甘油酯。

化合物3無(wú)定形粉未，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:6.42 (1H,dd,J=11.5,4.0 Hz),5.94 (1H,t,J=13.2 Hz),5.62 (1H,dd,J=7.5,6.0 Hz),5.34 (1H,q,J=8.0 Hz),3.97 (2H,m)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:174.8 (C-1),70.8 (C-2),138.1 (C-3),128.5 (C-4),34.1 (C-5),123.9 (C-6),130.8 (C-7)。從以上數(shù)據(jù)可分析并與相關(guān)文獻(xiàn)[8,9]對(duì)比可得化合物3為3-十七烷酸-環(huán)己-1,4-二烯酯。

化合物4無(wú)定形粉未，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO，500 MHz) δ:5.32 (4H,m),3.61 (1H,m),3.44 (2H,q,J=8.0 Hz)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ:172.9 (C-1),65.2 (C-2),33.4 (C-3),129.7 (C-4),127.8 (C-5),34.1 (C-6),127.7 (C-7),129.6 (C-8)。從以上數(shù)據(jù)可分析并與相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]對(duì)比可得化合物4為1,4-環(huán)己二烯-3-十五烷酸甲酯。

圖1 化合物1～4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-4

4 結(jié)論

乳腺增生的發(fā)病多是因?yàn)榇萍に?、孕激素和催乳素比例失調(diào)，其中，高血催乳素是乳腺增生發(fā)病的重要原因。根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和文獻(xiàn)[2]可知，大麥芽醇提物具有抑制PRL分泌的作用是確定的，本研究通過(guò)對(duì)小鼠血清PRL含量的測(cè)定，顯示造模后小鼠體內(nèi)血清PRL含量明顯高于正常組大鼠。同時(shí)，與模型組比較，乙酸乙酯組小鼠的血清PRL水平明顯降低，石油醚組、正丁醇組和萃余物組均無(wú)顯著變化，說(shuō)明大麥芽乙酸乙酯萃取物具有明顯的抑制PRL分泌的作用。

乙酸乙酯萃取物經(jīng)MCI柱、ODS柱和ODS-A柱分離得到的四個(gè)主要化合物，經(jīng)核磁鑒定分別為3-甲基-1-十六烯酸乙酯甘油酯、3-甲基-1-十八烯酸乙酯甘油酯、3-十七烷酸-環(huán)己-1,4-二烯酯、1,4-環(huán)己二烯-3-十五烷酸甲酯。這四個(gè)化合物中前二個(gè)為甘油酯類化合物，后二個(gè)為環(huán)己二烯類化合物，均是首次從大麥芽具有抑制PRL分泌的活性部位中分離出來(lái)的，目前也無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道這些化合物關(guān)于抑制PRL分泌的活性。

在我們前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)中通過(guò)TLC比較，發(fā)現(xiàn)這些成分在大麥中并未見(jiàn)到，我們推測(cè)可能是大麥在發(fā)芽過(guò)程中產(chǎn)生的活性成分，但至于甘油酯類化合物和環(huán)己二烯類化合物哪一個(gè)單體或哪一類化合物是抑制PRL分泌的有效成分，還需要我們進(jìn)一步研究。