◎ 陶大利，李 琴，白 鶴

（農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150090）

維生素B1（Vitamin B1）又稱硫胺素，其分子包含一個(gè)嘧啶環(huán)和一個(gè)噻唑環(huán)，通過(guò)一個(gè)亞甲基連接而組成[1]。維生素B1是人體必不可少的一種水溶性B族維生素，具有保護(hù)人體神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的作用，還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、增加食欲等[2]。目前，有關(guān)維生素B1的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[3]、熒光分光光度計(jì)法[4-5]、化學(xué)發(fā)光法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.84-2016《食品中維生素B1的測(cè)定》采用高效液相色譜法，前處理采用衍生的方式用熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)測(cè)定，但實(shí)際測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)回收率始終偏低，僅為80%～85%，分析原因發(fā)現(xiàn)樣品溶液中維生素B1的衍生程度低于標(biāo)準(zhǔn)品中溶液中維生素B1的衍生程度，導(dǎo)致回收率偏低。為此，本研究旨在對(duì)樣品前處理的衍生條件進(jìn)行了優(yōu)化，使方法的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度都有一定的提升。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與耗材

甲醇（色譜純）、乙酸鈉（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、正丁醇（色譜純）、鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、氯化鉀（分析純）、木瓜蛋白酶（生化試劑）和維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品。

衍生劑：稱取1 g亞鐵氰化鉀，用一級(jí)水溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容混勻；移取5 mL亞鐵氰化鉀溶液于100 mL容量瓶，用140 g·L-1氫氧化鈉溶液定容混勻即可，此時(shí)濃度為0.5 mg·mL-1亞鐵氰化鉀氫氧化鈉（140 g·L-1）。

1.2 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器，waters公司）、ML204萬(wàn)分之一精密電子天平（梅特勒托利多）、3-30K高速冷凍離心機(jī)（SIGMA）、S40K酸度計(jì)（梅特勒托利多）、超純水器（Thermo）、36D高壓滅菌鍋（廈門致微）。

1.3 樣品前處理

（1）樣品提取。奶粉稱取5 g，液體奶稱取15 g（精確到0.01 g）試樣于100 mL棕色三角瓶中，加入0.1 mol·L-1鹽酸40 mL充分混勻，放入高壓鍋中121 ℃滅菌30 min，取出冷卻至室溫，用2.0 mol·L-1乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.0左右，加入2 mL木瓜蛋白酶溶液，置培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，將全部液體轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，過(guò)濾備用。

（2）樣品衍生。移取2 mL濾液于30 mL具塞離心管中，加入8 mL一級(jí)水、2.5 g氯化鉀，混合均勻，加入5 mL衍生劑混勻，再加入10 mL正丁醇，振蕩1 min，置離心機(jī)內(nèi)4 000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)試。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品衍生。配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，0.02、0.04、0.08、0.12、0.24 μg·mL-1和 0.36μg·mL-1，分別移取10 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液于30 mL具塞離心管中，除不加水其他按樣品衍生步驟操作。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18250×4.6 mm，5 μm液相色譜柱；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1乙酸鈉溶液（pH4.5）+甲醇（70+30）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)375 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相比例的選擇

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用0.05 mol·L-1乙酸鈉溶液∶甲醇（65∶35體積比），在水與甲醇混合比例不同時(shí)，混合液的黏度會(huì)發(fā)生較大變化，在實(shí)際使用中當(dāng)甲醇水比例為35%時(shí)，產(chǎn)生的柱壓近20 684 kPa，長(zhǎng)期高柱壓會(huì)導(dǎo)致柱壽命的縮短。為此筆者對(duì)甲醇比例作了調(diào)整，經(jīng)測(cè)試乙酸鈉與甲醇的比例降至70∶30時(shí)，柱壓可降至17 237 kPa，維生素B1衍生物的出峰時(shí)間也可以控制在10 min以內(nèi)，且能實(shí)現(xiàn)與干擾物的分離，另外，提高柱溫對(duì)降低柱壓有促進(jìn)作用，最終確定流動(dòng)相為70∶30的乙酸鈉、甲醇，柱溫為40 ℃。樣品與標(biāo)樣疊加譜圖見(jiàn)圖1（標(biāo)樣濃度0.03 μg·mL-1）。

圖1 維生素B1標(biāo)樣與樣品譜圖疊加圖

2.2 衍生條件的優(yōu)化

取9 mL樣品濾液加入1 mL 2μg·mL-1維生素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液作加標(biāo)樣，另取9 mL樣品濾液加入1 mL一級(jí)水作空白樣，同時(shí)取1 mL 2 μg·mL-1維生素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液加9 mL一級(jí)水作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法操作，加入0.5 mg·mL-1亞鐵氰化鉀氫氧化鈉（100 g·L-1）溶液5 mL，混勻，再加入10 mL正丁醇充分混勻，離心取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)試，樣品峰面積見(jiàn)表1。由表1可以看出，相同濃度的維生素B1（0.2 μg·mL-1）在純水中和樣品中衍生的程度存在較大的差異。

表1 加標(biāo)溶液比對(duì)表

針對(duì)此問(wèn)題，本文對(duì)衍生過(guò)程中試劑的用量及操作條件做了研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)涉及的試劑和條件有亞鐵氰化鉀濃度變化、氫氧化鈉濃度變化、衍生時(shí)間變化、取樣量的變化這4個(gè)條件，分別對(duì)4個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，改變其中一個(gè)條件，保持其他條件按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法不變，得到以下結(jié)果。

（1）亞鐵氰化鉀溶液濃度的變化。分別配制0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg·mL-1和 0.8 mg·mL-1亞鐵氰化鉀溶液，其他衍生條件按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)操作，維生素B1理論濃度0.2 μg·mL-1，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，衍生劑濃度在0.5 mg·mL-1，衍生后的熒光值最高，亞鐵氰化鉀濃度過(guò)高，可能會(huì)出現(xiàn)過(guò)度氧化導(dǎo)致熒光值下降。故亞鐵氰化鉀最佳濃度選擇0.5 mg·mL-1。

圖2 亞鐵氰化鉀變化趨勢(shì)圖

（2）氫氧化鈉濃度變化。分別配制60、80、100、120、140 g·L-1和 160 g·L-1氫氧化鈉溶液，溶解亞鐵氰化鉀，配制成亞鐵氰化鉀均為0.5 mg·mL-1，其他條件按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法操作，得到結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3分析，隨著氫氧化鈉濃度的增加，熒光值逐漸增加，到140 g·L-1時(shí)基本穩(wěn)定，故氫氧化鈉濃度選擇140 g·L-1。

圖3 氫氧化鈉變化趨勢(shì)圖

（3）衍生時(shí)間變化。即加入亞鐵氰化鉀溶液后，放置時(shí)間的變化，分別設(shè)置1、2、4、6、8 min和10 min，其他按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)操作，發(fā)現(xiàn)不同的放置時(shí)間的樣品峰面積沒(méi)有明顯的差異，說(shuō)明衍生時(shí)間的變化對(duì)衍生的程度沒(méi)有影響。

（4）衍生樣品用量的變化。分別吸取1、2、4、6、8 mL和10 mL樣品，再分別用一級(jí)水補(bǔ)足到10 mL，分別按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法衍生，得到的峰面積再折算成1 mL樣液產(chǎn)生的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 衍生樣品用量對(duì)比表

由表2可以看出，樣品的取樣量越小，折算成1 mL樣液衍生的峰面積越大，說(shuō)明樣品中的雜質(zhì)干擾對(duì)維生素B1的衍生有一定的影響，降低樣品的取樣量有利于樣品中維生素B1衍生的完全，當(dāng)取樣量為2 mL時(shí)，方法的檢出限仍可以滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

由于維生素B1的衍生物用正丁醇提取，但提取后發(fā)現(xiàn)正丁醇稍渾濁，查找正丁醇化學(xué)性質(zhì)，正丁醇微溶于水，這樣就會(huì)使正丁醇與水溶液分離不夠徹底，提取體積不夠精確，同時(shí)考慮到衍生過(guò)程中使用高濃度氫氧化鈉，也會(huì)使少量的氫氧化鈉混入正丁醇中，如此進(jìn)樣會(huì)損傷色譜柱，降低色譜柱的壽命，利用鹽析的原理在衍生過(guò)程中加入一定量的氯化鉀，有利于正丁醇與水相的分層，使正丁醇更澄清。

綜合以上優(yōu)化的條件，最終確定取樣2 mL，加入8 mL一級(jí)水、2.5 g氯化鉀、0.5 mg·mL-1亞鐵氰化鉀氫氧化鈉溶液（140 g·L-1）5 mL渦旋混勻，加入10 mL正丁醇充分振蕩1 min，離心后取上清液過(guò)0.45 μm濾膜上機(jī)測(cè)試。采用新優(yōu)化的衍生條件進(jìn)行樣品重復(fù)性測(cè)試見(jiàn)表3和加標(biāo)回收試驗(yàn)見(jiàn)表4，經(jīng)試驗(yàn)回收率在93.5%～98.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.69%（n=6）。

表3 重復(fù)性測(cè)試表

表4 加標(biāo)回收率測(cè)試結(jié)果表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、衍生條件的優(yōu)化，提高了氫氧化鈉的使用濃度，降低了衍生樣品的取樣量，有效提高了乳制品中維生素B1的回收率，該方法回收率可達(dá)93.5%～98.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.69%（n=6）。適用于乳制品中維生素B1的測(cè)定。