宋利沙 蔣妮 藍(lán)祖栽 郭曉云 張占江

摘要：研究廣西青天葵內(nèi)生真菌的抗菌活性，并篩選出具有抗菌活性的菌株。從廣西青天葵植株中共分離得到23株內(nèi)生真菌，以15種病原真菌為指示菌株，用平板對峙法對分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌MQY-1對多種病原真菌指示菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，結(jié)合其形態(tài)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果，將其鑒定為Colletotrichum truncatum，證明青天葵中存在一定的抗菌活性物質(zhì)，為尋找新型抑菌物質(zhì)提供一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藥用植物;內(nèi)生真菌;青天葵;抑菌活性;拮抗真菌;抑菌譜

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0175-04

收稿日期：2019-01-26

基金項目：廣西藥用植物園青年基金（編號：桂藥基201801）;廣西科技基地人才專項（編號：桂科AD16380013）;有機(jī)藥材種植與評價研究團(tuán)隊（編號：桂藥創(chuàng)2019007）;中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項（編號：桂科ZY1949023）;廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局項目（編號：gzzc1225）。

作者簡介：宋利沙（1987—），女，河南鶴壁人，博士，助理研究員，主要從事中藥材病蟲害防治研究。E-mail：lishasong@126.com。

通信作者：蔣妮，碩士，副研究員，主要從事中藥材病蟲害防治研究。E-mail：jiangni292@126.com。

青天葵[Nervilia fordii（Hance）Schltr.]屬蘭科芋蘭屬植物，別稱獨葉蓮、珍珠葉、天葵、地沙、半邊傘、青蓮、芋蘭等，主要分布在廣東、廣西和海南等地，生長于海拔400～600 m的山林陰濕處、田邊等，首載于《嶺南采藥錄》，為華南地區(qū)的特有藥材。全草可供藥用，性寒味甘，具有潤肺止咳、清熱解毒、散瘀止痛等功效，主治肺癆咯血、肺熱咳嗽、口瘡、咽喉腫痛、跌打損傷等癥[1-7]。

內(nèi)生真菌是指在其生活史的某一時期生活在不同植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌，普遍定殖在健康植物組織和器官中，種類繁多，分布廣泛[8]。近年來的研究表明，從健康藥用植物的不同組織器官中可分離到多種內(nèi)生真菌，采用不同的培養(yǎng)基可篩選出多種能夠產(chǎn)生抑制病原真菌的活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，如從人參中分離到的2株內(nèi)生真菌Fusarium sp.PN8和Aspergillus sp.PN17，具有抗菌活性，并可用于發(fā)酵制備人參皂苷等成分[9];從印度藥用植物黃花稔（Sida acuta）中分離得到的具有抗菌活性的硫色曲霉（Aspergillus sulphureus），可抗金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌[10];Shah等發(fā)現(xiàn)，光果甘草的內(nèi)生真菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）具有抗結(jié)核的作用[11];從印度芳香植物檸檬馬薄荷（Monarda citriodora）中分離得到28株內(nèi)生真菌，分別來自11個屬，包括鐮刀菌、黃曲霉、毛孢霉屬（Muscodor）等，具有開發(fā)植物生物防治物質(zhì)的潛力[12];Gupta等發(fā)現(xiàn)，姜黃（Curcuma longa）的內(nèi)生真菌草莖點霉（Phoma herbarum）具有拮抗斑葉病的活性等[13]。本試驗從藥用植物青天葵的球莖、莖、葉中進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，并初步篩選出抗菌活性較強(qiáng)的內(nèi)生真菌菌株，旨在為尋找新的抗菌藥物資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試指示菌

供試的15種病原真菌分別為三七灰霉病菌（Botrytis sp.）、三七根腐病菌（Fusaium solani）、豆蔻葉斑病菌（Phyllosticta sp.）、香蕉葉斑病菌（Alternaria sp.）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、苦玄參葉斑病菌（Alternaria sp.）、香蕉炭疽病菌（Colltetorrichum sp.）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、三七黑斑病菌（Alternaria panax）、廣西莪術(shù)葉斑病菌（Phomopsis sp.）、煙草灰霉病菌（Botrytis cinerea）、三七炭疽病菌（Colltetorrichum gloeosporioides）、艾納香褐斑病菌（Phoma sp.）、腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌（Colletotrichum dematium）、羅漢果葉斑病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum），均是由筆者所在植物病理研究室保存的菌株。

1.1.2供試樣品

2018年11月在廣西馬山縣青天葵種植區(qū)（108.17°E，23.72°N）采集青天葵健康植株的球莖、莖、葉并進(jìn)行編號，封存于保鮮袋中，48 h內(nèi)完成內(nèi)生真菌的分離。

1.1.3供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，其組成為馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，用于植物病原真菌培養(yǎng)和菌株拮抗效果測定。

1.2試驗方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法，參考Guo等的方法[14]并進(jìn)行改進(jìn)，取健康青天葵的根、莖、葉用無菌水洗凈，晾干，剪成長寬均為5 mm左右的小塊，在無菌操作臺上，用75%乙醇表面消毒30 s，0.1% HgCl2消毒3 min，再用75%乙醇表面消毒30 s，最后用無菌水沖洗3次，將根、莖、葉的小塊接種于PDA平皿中，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待菌落長出，挑取尖端菌絲純化培養(yǎng)。純化后的菌株保藏于廣西壯族自治區(qū)藥用植物園病理研究室。

1.2.2內(nèi)生真菌的抗菌篩選

采用平板對峙法[15-16]進(jìn)行拮抗真菌的初篩，在直徑為9 cm的盛有PDA培養(yǎng)基的平板中央接種直徑為5 mm的病原菌組織塊，在距該病原菌組織塊2 cm 的3個角點處等距離接種生防真菌，以只接種病原菌菌塊為對照。每個處理設(shè)3次重復(fù)，于28 ℃ 條件下恒溫培養(yǎng)，7 d后測抑制率大小，篩選出對病原真菌有拮抗作用的內(nèi)生真菌。復(fù)篩與初篩方法一樣。

1.2.3內(nèi)生真菌抗菌譜的測定

抗菌譜測定方法參考“122”節(jié)，測量病原菌菌落直徑和抑制率;將直徑為6 mm的內(nèi)生真菌菌塊組織置于已加入混懸液的PDA固體培養(yǎng)基上，測量抑菌圈直徑。

1.2.4內(nèi)生真菌的鑒定

1.2.4.1形態(tài)鑒定

將拮抗真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～15 d，記錄菌落形態(tài)[17]，在光學(xué)顯微鏡下，觀察并記錄其分生孢子和子實體結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征。

1.2.4.2分子生物學(xué)鑒定

采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3（1.25 U/50 μL）（TAKARA BIO INC.，Japan，cat. no. R076A）試劑盒，挑取培養(yǎng)拮抗真菌的菌落作為模板直接用于PCR反應(yīng)。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在50 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括2×MightyAmp buffer （1×） 25 μL、10×Addtitive for High Specificity（1×） 5 μL、正反引物各1.5 μL（15 pmol），加ddH2O定容至50 μL。PCR反應(yīng)程序如下：98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，40個循環(huán);最后在68 ℃下延伸10 min。空白對照為ddH2O。吸取2.5 μL PCR產(chǎn)物加入1%（W/V）瓊脂糖凝膠的孔中，將凝膠置于1×TAE緩沖液中，在130 V下電泳30 min，用凝膠成像法檢測目的條帶。將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank中的序列進(jìn)行BLAST比對。利用MEGA 6.0軟件的鄰位連接法（Neighbor-Joining法）構(gòu)建內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。

真菌種屬地位的確定，依據(jù)目標(biāo)序列和參考序列進(jìn)行BLAST比對之后，同源性≥95%，將其暫定為同1個屬;相似性≥99%，暫定為同1個種。

1.2.5內(nèi)生真菌菌落形態(tài)觀察

用光學(xué)顯微鏡觀察處理菌株和對照菌株菌絲體的形態(tài)特征，拍照并記錄。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌的分離

通過常規(guī)組織分離法，從青天葵的塊莖、莖和葉中共分離得到23株內(nèi)生真菌純化菌株，其中葉中9株，莖中11株，塊莖中3株，可以看出莖的分離率最大，達(dá)47.83%，其次是葉（39.13%）和塊莖（13.04%）。針對這23株真菌菌株，在不同組織中選出不同的形態(tài)類型，共計13株進(jìn)行分子鑒定（表1）。

2.2內(nèi)生真菌的鑒定

“2.1”節(jié)中的13株菌株經(jīng)PCR反應(yīng)和測序得到的序列與Genbank中5株真菌的參考序列相似性達(dá)到99%，屬于同屬不同的種?；贗TS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示，這13株青天葵內(nèi)生真菌屬于5個不同分支，并有較高的支持率。MQY-1、MQY-3、MQJ-2、MQJ-9這4株菌株在同一個分支上，屬于平頭刺盤孢[Colletotrichum truncatum（KX364059）];MQJ-11和MQJ-12構(gòu)成一個支持強(qiáng)度很高的分支，屬于博寧刺盤孢[Colletotrichum boninense（KX343044）];MQJ-4與暹羅刺盤孢[Colletotrichum siamense（KY421040）]構(gòu)成一個分支，支持率達(dá)到99%;MQKJ-1、MQKJ-2和MQY-6聚類在一起，該類群屬于膠孢炭疽菌膠胞刺盤孢[Colletotrichum gloeosporioides（MH790247）]?？梢姡@13株菌株都屬于刺盤孢屬（Colletotrichum sp.），占分離總數(shù)的56.52%，是青天葵內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群。

2.3內(nèi)生真菌的抗菌活性

以15種病原真菌為指示菌，采用平板對峙法進(jìn)行青天葵內(nèi)生真菌的抑菌活性研究，結(jié)果表明，23株內(nèi)生真菌中，只有MQY-1對這15種病原真菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，平均抑制率達(dá)65.00%（表2），具有抑菌廣譜性;其中對煙草灰霉病和三七灰霉病抑制率較高，分別為89.70%、80.00%;而對豆蔻葉斑病、羅漢果葉斑病、香蕉枯萎病和西瓜枯萎病的抑制率較低，分別為51.88%、53.59%、54.02%、55.56%。

2.4抑菌活性菌株的形態(tài)特征

MOY-1具有抗菌廣譜性，因此，在生物顯微鏡下對該菌的形態(tài)特征進(jìn)行觀察和鑒定。圖2顯示，該菌株菌落表層有1層白色絨狀的菌絲，生長較快，不產(chǎn)分生孢子。綜合其形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果鑒定該菌株為C. truncatum。

3討論與結(jié)論

藥用植物內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物的不同組織和器官中，種類多樣，且分布廣泛。青天葵是我國特有的瀕危藥用植物，在自然條件下生長很慢，主要靠球莖繁殖，其球莖休眠期可長達(dá)6個月，無法滿足人類對其有效成分的臨床需求。內(nèi)生真菌可存在于不同的植物中，與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化，在此漫長的共同進(jìn)化過程中，彼此形成平衡穩(wěn)定的互利共生和特殊的寄生關(guān)系[8]。許多內(nèi)生真菌不僅從宿主植物中吸取營養(yǎng)物質(zhì)滿足自身生長發(fā)育需要，而且可提高宿主植物對環(huán)境脅迫的抗性，如抗病蟲害、抗干旱等抗性;同時，也可產(chǎn)生具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，為開發(fā)新藥和新的化合物提供重要依據(jù)。

本研究從青天葵的塊莖、莖和葉中分離得到23株內(nèi)生真菌，不同組織內(nèi)生真菌分布不同，以莖中的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，而塊莖中分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量最少，原因可能是地上部分和地下部分環(huán)境差異較大。這23株菌株鑒定屬于同一個屬，可以看出，青天葵內(nèi)生真菌資源單一，與其他植物存在差異[18]，需要從不同采樣點采用不同分離方式進(jìn)行再次分離鑒定方能驗證。對這23株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性的篩選，獲得1株抑菌活性較強(qiáng)的菌株MQY-1（C. truncatum），該菌株對多種病原真菌有一定的抑制作用，具有一定的應(yīng)用價值，其具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物、發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及其對植物生長的影響等方面還有待進(jìn)一步深入研究。

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