趙玲, 易善永, 閆曉倩, 郜輝

近年來(lái),分子靶向治療在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的綜合治療中占極重要的地位,腫瘤個(gè)體生物學(xué)特性的差異是個(gè)體化治療的基礎(chǔ),比如針對(duì)在NSCLC中檢測(cè)到的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-llike 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)和ROS1(repressor of silencing 1)等基因的個(gè)體化治療[1-3],為肺癌的治療掀開(kāi)了新的篇章。目前臨床上針對(duì)肺癌的靶向治療藥物主要有表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)和作用于EML4-ALK、ROS1靶點(diǎn)的克唑替尼。研究證明,EGFR突變及ALK基因融合表達(dá)的患者接受相應(yīng)靶向治療的療效優(yōu)于含鉑的兩藥化療方案,然而在靶向治療過(guò)程中,一些突變耐藥基因的出現(xiàn)會(huì)直接導(dǎo)致治療的失敗,如T790M突變[2];因此,在治療前了解基因突變的狀態(tài),以及在治療過(guò)程中實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)耐藥基因的出現(xiàn)對(duì)NSCLC的個(gè)體化治療尤為重要。

臨床上最常用的肺癌基因檢測(cè)標(biāo)本是組織學(xué)標(biāo)本,但只有約30%的患者能夠獲取足夠的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。取材不方便、開(kāi)展實(shí)時(shí)活檢很難被患者接受,尤其是身體狀況較差的患者。而液態(tài)活檢是對(duì)腫瘤患者的體液進(jìn)行檢測(cè),主要是通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞釋放到體液中的標(biāo)志物信息來(lái)獲得患者體內(nèi)腫瘤基因或蛋白表達(dá)的信息。液態(tài)活檢的主要檢測(cè)標(biāo)本是血液、尿液和唾液等[4-5]。目前臨床上通過(guò)血液檢測(cè)的主要有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、腫瘤衍生外泌體(tumor-derived txosomes, TEXs)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、血漿蛋白和代謝物等[6-7],而臨床上最常檢測(cè)的是ctDNA、CTCs和TEXs。液態(tài)活檢是一種非侵入性的檢測(cè)方法,取材方便,容易被患者接受,成為目前臨床上最有應(yīng)用前景的腫瘤組織標(biāo)本替代品;現(xiàn)將液態(tài)活檢技術(shù)在NSCLC分子靶向治療中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 ctDNA

1.1 ctDNA的概述 1948年,Mandel和Métais發(fā)現(xiàn)人的外周血中可檢測(cè)到循環(huán)游離DNA。1977年,研究人員在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤DNA的存在;1994年,在腫瘤患者的外周血中檢測(cè)到了癌基因RAS的變異,表明部分循環(huán)DNA來(lái)自于腫瘤。ctDNA主要有3個(gè)來(lái)源:凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞、CTCs和TEXs[8-9]。研究證實(shí)在多種腫瘤患者的外周血中檢測(cè)到ctDNA,它與腫瘤組織的DNA具有高度的一致性,并且其濃度與腫瘤的大小、分期呈正相關(guān)[8-10]。此外,ctDNA的檢測(cè)也能輔助對(duì)肺癌的診斷與分期,并可指導(dǎo)肺癌的個(gè)體化用藥及對(duì)耐藥性的分析。

1.2 ctDNA的檢測(cè)方法 由于來(lái)自正常組織的DNA含量較高,而細(xì)胞游離DNA只是其中的一小部分,因此獲得和分析ctDNA要比CTCs難度更大。目前,ctDNA的檢測(cè)方法主要包括:突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)、二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)和微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)。以ddPCR和NGS為基礎(chǔ)的DNA突變檢測(cè)技術(shù)日趨發(fā)展成熟。ddPCR技術(shù)已普遍用于檢測(cè)靶向DNA突變,雖然基于PCR的技術(shù)具有很高的靈敏度,可用于監(jiān)測(cè)低至0.01%的腫瘤相關(guān)基因突變,但該技術(shù)只能檢測(cè)有限數(shù)量的病灶[11-12]。因此,ddPCR技術(shù)在監(jiān)測(cè)過(guò)程中可能會(huì)遺漏大量信息。NGS技術(shù)能更全面的獲得整個(gè)基因組區(qū)域的信息,它提供了個(gè)體化癌癥基因圖譜的特征和開(kāi)發(fā)個(gè)體化醫(yī)學(xué)的機(jī)會(huì)。在越來(lái)越多的驅(qū)動(dòng)程序突變測(cè)試的背景下,NGS表現(xiàn)出了更多的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樗梢愿咝У耐瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的突變。Rothé等[8]首先在晚期乳腺癌患者中進(jìn)行了深入覆蓋的NGS檢測(cè),檢測(cè)了50個(gè)基因熱點(diǎn)區(qū)域的突變,并在24%的患者中發(fā)現(xiàn)了原發(fā)腫瘤的DNA與血漿之間的不一致突變。但由于其成本較高,尤其是數(shù)據(jù)管理的復(fù)雜性,該技術(shù)的臨床應(yīng)用受到了一定的限制。相信在不久的將來(lái),隨著基因組技術(shù)和生物信息學(xué)靈敏度的不斷提高,NGS技術(shù)能夠在ctDNA分析應(yīng)用中發(fā)揮核心作用。

1.3 ctDNA在肺癌靶向治療中的應(yīng)用 ctDNA在腫瘤的診斷、腫瘤分子異質(zhì)性、腫瘤動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)、尋找靶點(diǎn)、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的價(jià)值。2015年歐洲肺癌年會(huì)公布了IGNITE研究結(jié)果[9],該研究檢測(cè)了2 581例NSCLC患者的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與ctDNA標(biāo)本的EGFR突變率,結(jié)果顯示,ctDNA標(biāo)本和組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)具有很高的一致性,且ctDNA具有較高的特異性,在亞太地區(qū)的患者中可以達(dá)到97.2%。Luo等[10]對(duì)20項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn),采用ctDNA與腫瘤組織活檢對(duì)EGFR進(jìn)行檢測(cè)具有同樣的診斷準(zhǔn)確性。Qiu等[13]對(duì)27項(xiàng)相關(guān)研究進(jìn)行Meta分析也發(fā)現(xiàn),ctDNA檢測(cè)的總敏感度為62%,特異度為96%。存在驅(qū)動(dòng)基因突變的NSCLC患者可以接受相應(yīng)的靶向治療,但目前的靶向治療藥物,無(wú)論是EGFR-TKI還是ALK抑制劑均會(huì)在1年左右出現(xiàn)耐藥,對(duì)EGFR-TKI藥物敏感的患者,當(dāng)出現(xiàn)病情進(jìn)展時(shí),約40%～60%的患者存在T790M突變。近期的一項(xiàng)研究通過(guò)組織標(biāo)本檢測(cè)到T790M突變率為47%,通過(guò)液態(tài)活檢(CTCs、ctDNA)檢測(cè)到突變率為50%,具有很高的檢測(cè)一致性[14]。而對(duì)于這部分患者耐藥性的準(zhǔn)確判定,實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)可能并不完全適用。所以通過(guò)液態(tài)活檢獲得耐藥基因的表達(dá)情況成了目前研究的重點(diǎn)方向之一。Sorensen等[15]采用PCR技術(shù)檢測(cè)23例進(jìn)展期NSCLC患者的血漿EGFR表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者對(duì)厄洛替尼有42種不同的敏感性表達(dá),在厄洛替尼應(yīng)用前后均進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示96%的患者在治療開(kāi)始階段L858R突變或19外顯子缺失呈下降趨勢(shì),沒(méi)有檢測(cè)到T790M突變,但隨著治療的進(jìn)行,39%的患者出現(xiàn)了T790M突變,因此,對(duì)T790M的持續(xù)監(jiān)測(cè)能夠較早發(fā)現(xiàn)肺癌患者的進(jìn)展;對(duì)T790M突變陽(yáng)性的NSCLC患者臨床上可應(yīng)用第三代TKIs靶向治療。2015年發(fā)表在Nature Medicine雜志上的關(guān)于三代EGFR-TKIs耐藥機(jī)制的研究對(duì)15例T790M突變的患者給予AZD9291治療,隨訪并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA的變化,發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了AZD9291獲得性耐藥的突變位點(diǎn)C797S[16]。AZD9291存在3種耐藥模式,一種是耐藥后T790M突變與C797S突變同時(shí)存在,另一種是耐藥后僅出現(xiàn)T790M的再次升高,第三種是耐藥后既不伴有T790M也無(wú)C797S的出現(xiàn)[15-16]。液態(tài)活檢可用于肺癌靶向治療效果及預(yù)后的預(yù)測(cè)。Imamura等[17]對(duì)52例EGFR突變陽(yáng)性且首次給予EGFR-TKI治療的NSCLC患者治療期間進(jìn)行血液EGFR突變檢測(cè),同時(shí)采用CT掃描與RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效,結(jié)果顯示患者血漿ctDNA水平與RECIST評(píng)價(jià)結(jié)果相吻合,表明ctDNA檢測(cè)可評(píng)價(jià)EGFR-TKI治療效果。Yang等[18]對(duì)73例晚期肺腺癌患者行EGFR-TKI治療前后的血漿樣本進(jìn)行ctDNA檢測(cè),結(jié)果顯示74%的樣本檢測(cè)到了EGFR突變,EGFR突變陽(yáng)性患者比野生型患者的預(yù)后更好,且EGFR高突變豐度(>5.15%)的患者相比于低突變豐度(≤5.15%)患者呈現(xiàn)了更好的預(yù)后。近年來(lái),有研究表明可以通過(guò)ctDNA檢測(cè)肺癌免疫抑制劑療效的分子標(biāo)記物如腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)。Gandara等[19]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)血液樣本中的TMB(bTMB)可以很好的預(yù)測(cè)患者能否從PD-L1抗體治療中獲益。研究人員先對(duì)兩個(gè)臨床隊(duì)列的bTMB與組織樣本的TMB(tTMB)進(jìn)行比較,確定了在整體上tTMB與bTMB確實(shí)呈正相關(guān)的關(guān)系,表明bTMB確實(shí)能夠作為免疫治療的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。

2 CTCs

2.1 CTCs的概述 1869年,澳大利亞學(xué)者Thomas Ashworth從一位轉(zhuǎn)移瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了CTCs。諸多研究認(rèn)為,腫瘤的原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落到外周血的細(xì)胞就叫CTCs,它可通過(guò)淋巴和血液系統(tǒng)決定腫瘤細(xì)胞向其他部位轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)證實(shí)CTCs在各種實(shí)體腫瘤患者的血液中廣泛存在,并與肺癌患者的轉(zhuǎn)移以及其他腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)[20-21]。

2.2 CTCs的檢測(cè)方法 在早期腫瘤患者血液中CTCs含量很少,即使在晚期腫瘤的患者每106～107個(gè)外周血細(xì)胞中也才發(fā)現(xiàn)一個(gè)CTCs,所以通過(guò)普通的檢測(cè)方法很難進(jìn)行檢測(cè)。CTCs的檢測(cè)流程主要分為兩部分:CTCs的富集及CTCs的檢測(cè)。最常用的CTCs分離方法是抗體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞捕獲技術(shù),CellSearchTM是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的唯一檢測(cè)CTCs的方法,它利用上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)涂層磁珠分離CTCs,但研究表明這種檢測(cè)方法在幾種類型的腫瘤中檢測(cè)效率卻很有限。而一種獨(dú)特的微流控平臺(tái)“CTCs芯片”能夠有效并選擇性地從外周血標(biāo)本中分離出具有活性的CTCs,CTCs芯片由一個(gè)微流控平臺(tái)(針對(duì)EpCAM或MUC 1的抗體)組成,它與CTCs相互作用和捕獲,提高了靈敏度,簡(jiǎn)化了預(yù)標(biāo)記樣品的步驟,這項(xiàng)技術(shù)成功地檢測(cè)到了約100%的肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的CTCs[20-22]。雖然這種檢測(cè)技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn),但是有一些腫瘤細(xì)胞亞群仍不能被檢測(cè)到,可能是因?yàn)檫@些細(xì)胞進(jìn)行了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此,有研究認(rèn)為需要將這兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行聯(lián)合分析,才能夠提高CTCs的檢測(cè)敏感度。其他的檢測(cè)方法還有逆轉(zhuǎn)錄PCR、酶聯(lián)免疫檢測(cè)及自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng),最近一項(xiàng)新的檢測(cè)方法四氯化碳分離技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái),其可以在很低的濃度下分離CTCs,希望在不久的將來(lái)這項(xiàng)技術(shù)能真正應(yīng)用于臨床。對(duì)于獲取的CTCs,可以從分子和細(xì)胞層面上進(jìn)一步進(jìn)行基因測(cè)序、基因表達(dá)分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、細(xì)胞免疫染色及細(xì)胞培養(yǎng)等[21-22]。

2.3 CTCs在肺癌靶向治療中的應(yīng)用 隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,NSCLC尤其是肺腺癌患者在治療前均需對(duì)EGFR及ALK基因的狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),從而為后續(xù)的靶向治療提供指導(dǎo)。目前多項(xiàng)研究證實(shí),通過(guò)CTCs來(lái)檢測(cè)EGFR、ALK的突變狀態(tài)和通過(guò)腫瘤組織檢測(cè)具有很高的一致性。有研究證明在組織與外周血CTCs中EGFR檢測(cè)率的一致性高達(dá)84%[23];另一項(xiàng)研究通過(guò)FISH方法檢測(cè)CTCs中ALK融合基因的表達(dá)情況,研究共檢測(cè)了32例晚期肺癌患者,在18例組織學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性的患者中,通過(guò)CTCs檢測(cè),ALK基因均為陽(yáng)性,14例組織學(xué)檢測(cè)為陰性的患者,通過(guò)CTCs檢測(cè)ALK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)≤1個(gè),并且CTCs中ALK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)可用于評(píng)估克唑替尼治療的效果[12]。Pailler等[24]在NSCLC患者中使用微流控裝置,應(yīng)用等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行EGFR突變擴(kuò)增,在CTCs中檢測(cè)到L858R、del 19和T790M突變;研究還發(fā)現(xiàn)T790M CTCs陽(yáng)性患者的無(wú)進(jìn)展生存期為7.7個(gè)月,而最初T790M陰性患者的無(wú)進(jìn)展生存期為16.5個(gè)月;另外通過(guò)對(duì)CTCs的序列進(jìn)行分析顯示,CTCs的增加與腫瘤的進(jìn)展有關(guān),在某些情況下還與新的EGFR突變出現(xiàn)有關(guān)。Aieta等[25]觀察1例NSCLC患者CTCs中EML-ALK水平,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)成功的克唑替尼治療后,CTCs降低。Ilie等[26]對(duì)87例肺腺癌患者進(jìn)行ALK FISH分析,5例組織活檢和CTCs分析均為陽(yáng)性。這些研究證實(shí)了CTCs檢測(cè)可以指導(dǎo)肺癌的治療,監(jiān)測(cè)治療耐藥性的出現(xiàn),并可用來(lái)預(yù)測(cè)晚期肺腺癌患者的生存期。2016年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)基于CTCs的PD-L1檢測(cè)對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物PD-1/PD-L1的臨床用藥具有指導(dǎo)作用,此研究將應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑治療的24例Ⅳ期NSCLC患者的CTCs數(shù)目和CTCs上的PD-L1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)在基線和治療3個(gè)月時(shí),CTCs及其PD-L1的表達(dá)與患者的不良反應(yīng)結(jié)果相關(guān);治療后6個(gè)月,所有患者血液中都發(fā)現(xiàn)CTCs,其中PD-L1陰性CTCs的患者都獲得較好的治療效果,而PD-L1陽(yáng)性CTCs的患者則出現(xiàn)了疾病進(jìn)展[27]。由此可看出通過(guò)檢測(cè)CTCs的PD-L1可成為抗PD-1治療的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

3 TEXs

3.1 TEXs的概述 外泌體是由活細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)、直徑40～100 nm的微小囊泡,是通過(guò)“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過(guò)程后而形成的胞外納米級(jí)多泡體[28-30]。膜內(nèi)主要包含有蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。TEXs主要包含miRNA和蛋白質(zhì),它通過(guò)與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞相互作用來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展、血管形成平衡、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。Thakur等[29]研究發(fā)現(xiàn),TEXs攜帶dsDNA,并且其DNA可以反映親代腫瘤細(xì)胞的突變狀態(tài)。研究表明TEXs可能是肺癌“液體活檢”的生物標(biāo)志物,TEXs能影響腫瘤微環(huán)境的形成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力、介導(dǎo)腫瘤免疫抑制及參與腫瘤放化療抵抗進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[30-32]。因此,TEXs可作為生物標(biāo)志物對(duì)腫瘤的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)提供一定的價(jià)值。另外,TEXs含有多種不同的免疫刺激和免疫抑制因子,這些因子支持受體細(xì)胞的重新編程,穿梭在信號(hào)分子和腫瘤抗原中,在細(xì)胞-細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。TEXs的外膜由鞘磷脂組成,這樣能保證外泌體的內(nèi)含物在體液中穩(wěn)定存在。因此,針對(duì)TEXs的液態(tài)活檢將為疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)體化治療提供更好的研究?jī)r(jià)值。

3.2 TEXs的檢測(cè)方法 TEXs的檢測(cè)包括分離純化及表征驗(yàn)證,科研工作者最關(guān)注的問(wèn)題是分離純化,高純度的TEXs是保證后續(xù)研究成功的關(guān)鍵。目前TEXs分離提取的方法主要有超速離心法、蔗糖梯度離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法及試劑盒提取等。超離法操作簡(jiǎn)單,且獲得的囊泡數(shù)量較多,成為了研究者最常用的TEXs分離純化的手段,但超速離心僅能富集TEXs或囊泡的亞型,不能起到純化的作用。TEXs提取純化后,在進(jìn)行臨床應(yīng)用前一般都需要對(duì)其進(jìn)行表征驗(yàn)證。目前表征驗(yàn)證的方法主要有兩種,一種是形態(tài)學(xué)觀察,即通過(guò)電鏡進(jìn)行觀察,可直觀了解和掌握TEXs的大小、形態(tài)等表觀信息[33-35]。另外一種是從分子蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證,它主要是采用Western blotting方法來(lái)檢測(cè)TEXs的表面標(biāo)志蛋白質(zhì),如CD9、CD63等,與形態(tài)學(xué)判斷比較此方法更為精準(zhǔn)。此外,還有一些其他方法,如動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、納米微粒追蹤分析術(shù)等[32-33]。流式細(xì)胞技術(shù)和納米微粒追蹤分析技術(shù)主要是通過(guò)熒光信號(hào)的傳導(dǎo)進(jìn)行測(cè)定,具有很高的分辨率和準(zhǔn)確度,并且能進(jìn)行定量和定性分析,但由于檢測(cè)成本較高,目前在臨床中還未能廣泛應(yīng)用。

3.3 TEXs在肺癌靶向治療中的應(yīng)用 大量研究表明TEXs可能是肺癌液態(tài)活檢的生物標(biāo)志物,它的靈敏度和特異度比傳統(tǒng)的活檢方法更高。研究人員檢測(cè)了肺癌TEXs的標(biāo)志物,如蛋白質(zhì)和非編碼RNA[34]。Sandfeld-Paulsen等[35]對(duì)276例NSCLC患者進(jìn)行了TEXs檢測(cè),并評(píng)估了附在體膜上的49種蛋白質(zhì),結(jié)果顯示50%的患者存在食管鱗狀細(xì)胞癌抗原(new york-esop hageal-1,NY-ESO-1)增高,其是一種非常特異的預(yù)后生物標(biāo)志物。肺癌患者中有兩種腫瘤抑制相關(guān)miRNA(miRNA-373、miRNA-512),它在激活狀態(tài)下對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲具有抑制作用,研究表明這兩種miRNAs水平的下調(diào)與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)[36]。通過(guò)對(duì)肺癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡分析發(fā)現(xiàn),TEXs表面高表達(dá)CD317和EGFR等,這些分子均可作為診斷NSCLC的可靠生物學(xué)標(biāo)志[34-36]。在臨床應(yīng)用方面,Exosome Diagnostics公司研發(fā)的基于血漿TEXs的ExoDx Lung(ALK)診斷試劑盒在2016年初已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。這是全球第一個(gè)以血液樣本分析TEXs RNA的臨床液態(tài)活檢試劑盒,其能夠準(zhǔn)確、靈敏、實(shí)時(shí)地檢測(cè)NSCLC患者的EML4-ALK突變情況。通過(guò)對(duì)腫瘤患者組織及血漿檢測(cè)ALK的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)檢測(cè)可以達(dá)到88%的診斷靈敏度和100%的特異度。Krug等[37]用NGS方法分析54例NSCLC患者的EGFR激活突變和T790M突變,結(jié)果示通過(guò)外泌體ES和ctDNA檢測(cè)EGFR活化突變與組織活檢結(jié)果的符合率為96%,T790M突變符合率為86%。這些結(jié)果表明,ES分析在肺癌診斷中具有一定的應(yīng)用價(jià)值,TEXs可作為肺癌潛在的治療靶點(diǎn),且由于肺癌TEXs成分和功能的多樣性,可以為肺癌的治療提供多個(gè)潛在的治療靶點(diǎn),如黑色素瘤相關(guān)基因(mda-9/syntenin)過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)小細(xì)胞肺癌釋放TEXs,通過(guò)以黑色素瘤相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的新藥可能為肺癌的治療帶來(lái)新方法。Yang等[38]也發(fā)現(xiàn)促進(jìn)TEXs中l(wèi)et-7的表達(dá)是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。Rolfo等[39]在研究NSCLC患者和正常人血清中TEXs時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-30b和miR-30c水平升高與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān),可進(jìn)一步用來(lái)指導(dǎo)靶向藥物治療的敏感性,同時(shí)miR-221-3p和miR-222-3p過(guò)度表達(dá)的患者都與其EGFR突變狀態(tài)有關(guān),在應(yīng)用AZD9291治療的過(guò)程中都取得了良好的效果。另外,Jung等[40]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞分泌的TEXs中多種蛋白質(zhì)成分和磷脂成分參與吉非替尼的耐藥性,提示TEXs參與了肺癌靶向藥物耐藥的發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞還能通過(guò)TEXs調(diào)節(jié)腫瘤免疫。主要是通過(guò)攜帶免疫抑制因子并抑制免疫細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞)發(fā)揮的抗腫瘤免疫效應(yīng),誘導(dǎo)免疫抑制和調(diào)節(jié)細(xì)胞群,如髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)等,而MDSCs具有抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。最新肺癌免疫治療方法之一依賴于阻斷T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)物,如PD-1和PD-L1以及腫瘤微環(huán)境中的炎性信號(hào)[41]。另一方面,TEXs可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的抗炎信號(hào),這可以有效增強(qiáng)肺癌免疫治療效果。因此,圍繞肺癌TEXs的治療研究將為探索肺癌個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療策略提供新的思路。

4 展望

液態(tài)活檢具有無(wú)侵入性、可頻繁多次檢測(cè)及快速反映機(jī)體變化等優(yōu)勢(shì),具有廣泛的應(yīng)用前景及廣闊的發(fā)展空間。它不僅可以指導(dǎo)肺癌的分子靶向治療及治療過(guò)程中的耐藥監(jiān)測(cè);還可以指導(dǎo)肺癌的免疫靶向治療。然而,現(xiàn)階段液態(tài)活檢還不能夠取代組織活檢的金標(biāo)準(zhǔn)地位。液態(tài)活檢所提供的信息還需要更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)做出更深層次的解讀。與傳統(tǒng)的腫瘤檢測(cè)方法相比,液態(tài)活檢是一個(gè)不斷發(fā)展的概念,隨著時(shí)間推移,其外延也在不斷擴(kuò)展。從廣為人知的血液檢測(cè)到現(xiàn)在的尿液、唾液檢測(cè);從蛋白類腫瘤標(biāo)志物檢測(cè),到如今的CTC、ctDNA,再到最近幾年興起的TEXs。液體活檢始終是一個(gè)試驗(yàn)性、探索性的課題。將來(lái)隨著檢測(cè)方法的不斷進(jìn)步,液態(tài)活檢技術(shù)一定能真正用于臨床指導(dǎo)肺癌的精準(zhǔn)治療,發(fā)揮更大的作用。