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(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250062)

白血病是血液系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其發(fā)生的主要機(jī)制是由于造血細(xì)胞在某一分化階段出現(xiàn)了分化障礙，不能繼續(xù)終末分化，而保留其惡性增殖的能力。通過藥物將白血病細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成熟細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的，是治療白血病的重要策略之一。這種療法的主要特點(diǎn)是選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟后自然死亡，而對(duì)正常組織細(xì)胞沒有明顯毒副作用，因而定向誘導(dǎo)分化將成為白血病治療的重要手段或途徑。自惡性腫瘤細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為較成熟細(xì)胞的方法提出以來，腫瘤誘導(dǎo)分化療法引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，建立誘導(dǎo)分化治療模式，研究白血病定向誘導(dǎo)分化關(guān)鍵機(jī)制，并在粒系細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、紅系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、以及樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)等定向誘導(dǎo)分化相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究方面都取得了較大的進(jìn)展[1-3]。現(xiàn)將白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究及肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)在白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用機(jī)制綜述如下。

1 白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化

我國學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，分別首創(chuàng)全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的方法，并獲得成功[1]，開創(chuàng)了臨床誘導(dǎo)分化白血病細(xì)胞成功治療白血病的先例。ATRA成為目前國內(nèi)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocyticleukemia，APL)、骨髓異常增生等血液惡性疾病的臨床首選藥物。除此以外，有關(guān)其他類型白血病的治療至今沒有取得明顯的突破，主要原因在于缺乏相對(duì)特異的新型終末分化誘導(dǎo)劑，或者某些類型的白血病細(xì)胞難以發(fā)生終末分化[2]。因此，目前國內(nèi)外學(xué)者把腫瘤誘導(dǎo)分化的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了新型終末分化誘導(dǎo)劑的發(fā)掘和白血病分化關(guān)鍵機(jī)制的研究。誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向粒系細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞分化對(duì)白血病治療有重要意義，其誘導(dǎo)方法和機(jī)制是白血病治療研究的熱點(diǎn)。

1.1 誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向粒系細(xì)胞分化

誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向粒系細(xì)胞分化是臨床誘導(dǎo)分化治療的主要措施。ATRA通過與維甲酸受體結(jié)合，引起維甲酸受體低磷酸化，導(dǎo)致受體融合蛋白的快速降解，從而誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)分化和促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)[3]，是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的首選藥物。其發(fā)揮治療白血病作用的主要機(jī)制是ATRA具有促進(jìn)白血病細(xì)胞向粒系分化的功能。基于ATRA誘導(dǎo)的人早幼粒急性白血病細(xì)胞株(HL60細(xì)胞)模型，有研究發(fā)現(xiàn)ATRA可以促進(jìn)HL60細(xì)胞內(nèi)肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase，PAD/PADI4)的表達(dá)。PADl4可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合sox4的啟動(dòng)子促進(jìn)白血病細(xì)胞的粒系分化[4]。此外，ATRA誘導(dǎo)人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞粒系分化, 促進(jìn)CD11b表達(dá)，其作用機(jī)制為ATRA通過上調(diào)TRIM22表達(dá)，使其靶向結(jié)合eIF4E而發(fā)揮作用[5]。通過研究ATRA對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用機(jī)制及信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)PADI4和TRIM22有望成為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病治療的新靶點(diǎn)。協(xié)同ATRA作用的效應(yīng)分子在促進(jìn)白血病細(xì)胞粒系分化中的研究也有一些報(bào)道。去泛素酶USP48可以促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化[6]。星形孢菌素可以通過MEK/ERK信號(hào)通路增強(qiáng)ATRA對(duì)人白血病U937細(xì)胞向粒細(xì)胞系的分化[7]。另外，人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)能夠誘導(dǎo)APL衍生的NB4細(xì)胞系以及原代APL細(xì)胞的粒細(xì)胞分化，并且還以協(xié)同方式促進(jìn)ATRA對(duì)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)的分化[8]。通過高通量蛋白質(zhì)組篩選ATRA對(duì)白血病細(xì)胞粒系誘導(dǎo)分化的作用靶點(diǎn)及其可能作用機(jī)制[9]，尋求新的治療靶點(diǎn)，為精準(zhǔn)調(diào)控誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的靶向分化奠定基礎(chǔ)。

1.2 誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化

樹突狀細(xì)胞(DC)是抗原提呈能力最強(qiáng)的一類免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與腫瘤特異性主動(dòng)免疫應(yīng)答。至今已了解有幾種可溶性因子如GM-CSF、白介素-3(interleukin-3，IL-3)、SCF和FLT3L等與DC分化有直接的復(fù)雜關(guān)系[10]。用內(nèi)源的方法可將白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為DC。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)聯(lián)合白介素4(IL-4)是誘導(dǎo)髓源性DC的經(jīng)典方法，但這種方法在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向DC分化中的效果尚不滿意，存在誘導(dǎo)效率低、體內(nèi)轉(zhuǎn)輸后不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。中藥與白血病細(xì)胞來源的成熟DC的關(guān)系引起越來越多的學(xué)者關(guān)注。在GM-CSF/IL-4聯(lián)合適當(dāng)濃度人參、附子的作用下，白血病細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為DC，能明顯增強(qiáng)白血病細(xì)胞源DC表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表達(dá)率、提高其刺激T淋巴細(xì)胞的增殖能力及培養(yǎng)上清液中IL-12的含量。人參皂苷Ro聯(lián)合細(xì)胞因子(GM-CSF與IL-4)促進(jìn)人單核白血病細(xì)胞(THP-1)向DC分化的作用[11]。雖然體外可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，但是卻只能使一部分白血病細(xì)胞分化為DC。在急性髓系白血病中常見的遺傳改變是FLT3的內(nèi)串聯(lián)重復(fù)(ITD)。FLT3-ITD突變直接影響DC的發(fā)育，間接調(diào)節(jié)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增，這種效應(yīng)可能會(huì)破壞免疫監(jiān)視，并促進(jìn)白血病細(xì)胞的發(fā)生[12]。遺傳性的變異可能是不能有效全部誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化為DC的一個(gè)重要原因。選擇合適有效的誘導(dǎo)因子和方法是促進(jìn)白血病細(xì)胞向DC分化的關(guān)鍵。近年來，源于急性髓細(xì)胞白血病患者的同種異體DC疫苗治療白血病取得較好的治療效果[13]。因此，開發(fā)有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞源DC的技術(shù)與方法有望在白血病治療領(lǐng)域取得突破。

1.3 誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化

白血病細(xì)胞尤其是M0、M1、M2、M3、M4和M5型急性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞都可向單核-巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并且單核-巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤功能。因此，結(jié)合誘導(dǎo)分化療法和巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控，將白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化誘導(dǎo)具有重要意義。巨噬細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，可極化為M1和M2型巨噬細(xì)胞。M1型又被稱為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages)，由干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或TLR激動(dòng)劑(如LPS等)誘導(dǎo)，具有較強(qiáng)的殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞的功能，可分泌TNF-α、白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-12等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答[14]。M2型巨噬細(xì)胞，又被稱為替代活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages)，可分為M2a、M2b和M2c亞型[14]。M2a由IL-4、IL-13誘導(dǎo)，主要發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的功能，可分泌CCL18、CCL22等趨化因子，高表達(dá)精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)、 Fizz1/Relma和YM1等基因，可誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答。M2b由免疫復(fù)合物和TLR或IL-1R的激動(dòng)劑誘導(dǎo)，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，可分泌IL-10等細(xì)胞因子。M2c由IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，可分泌IL-10等細(xì)胞因子[14]。佛波酯PMA已被證實(shí)可通過促進(jìn)TGF-β/SMAD信號(hào)的傳導(dǎo)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞分化[15]。雖然目前多種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如佛波酯，維甲酸和hexamethylene bisacetamide(HMBA)等在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中有良好的誘導(dǎo)分化作用，但對(duì)機(jī)體副作用較多。此外，中藥重樓皂苷D能夠明顯上調(diào)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞分化[16]。

2 肽酰基精氨酸脫亞胺酶白血病誘導(dǎo)分化中的研究

以往研究發(fā)現(xiàn)肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)在白血病誘導(dǎo)分化過程中起關(guān)鍵作用。肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)是催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的關(guān)鍵酶。人類PAD分別為PADI、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6，簇集在染色體1P36.13上。PAD主要參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，在Ca2+離子存在下能將蛋白多肽鏈中的精氨酸(Arginine)殘基催化成瓜氨酸(Citrulline)，在細(xì)胞分化、凋亡以及基因調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。其中，PADI4主要表達(dá)于造血組織，例如骨髓、脾和外周血的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中。PADI4的cDNA編碼663個(gè)氨基酸，與其它PADI有50%～55%序列同源性。PADI4的高表達(dá)與細(xì)胞凋亡有關(guān)，而其低表達(dá)則與細(xì)胞分化有關(guān)。

2.1 PADI4和腫瘤

PADI4在白血病、結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌等絕大多數(shù)惡性腫瘤患者血液中有特異性的高表達(dá)[17]，但在正常和良性腫瘤中不表達(dá)或者表達(dá)很低，表明PADI4與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。PADI4通過調(diào)控細(xì)胞的凋亡在腫瘤中發(fā)揮作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制主要是：(1)PADI4能夠作為p53、ELK1、p300、p21等的協(xié)同調(diào)節(jié)因子[18-19]，調(diào)節(jié)H2A、H3、H4組蛋白的瓜氨酸化[18]。PADI4將組蛋白H3甲基化位點(diǎn)的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釓亩种艸3甲基化，抑制p53對(duì)靶基因OKL38、p21、CIP1、WAF1等表達(dá)的調(diào)控，影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期[19]；介導(dǎo)H4精氨酶3的瓜氨酸化，導(dǎo)致DNA損傷部位染色質(zhì)解凝，促進(jìn)p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。(2)PADI4可將抗凝血酶(antithrombin，AT)瓜氨酸化，抑制了AT對(duì)凝血酶的抑制活性，而凝血酶活性的升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。(3)纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)可與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、整合素受體、生長(zhǎng)因子等相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、分化及增殖等方面具有重要的作用，PADI4可將其瓜氨酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。瓜氨酸化的Fn與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的結(jié)合增強(qiáng)，而與整合素受體的結(jié)合能力下降，且不能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。(4)PADI4也可通過對(duì)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)的瓜氨酸化干擾細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

2.2 PADI4參與白血病細(xì)胞分化的作用機(jī)制及信號(hào)通路

在研究ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)PADI4具有調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞增殖的作用[20]。PADI4在白血病細(xì)胞HL-60粒系分化過程中有促進(jìn)分化的作用[20]。調(diào)控PADI4活性狀態(tài)，有可能使之成為調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞分化的新靶點(diǎn)。在白血病細(xì)胞的分化過程中，PADI4可能通過對(duì)下游蛋白或組蛋白H2、H3、H4的瓜氨酸化調(diào)控了細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因或蛋白的功能。有研究表明，PADI4能夠催化H3組蛋白的瓜氨酸化，并且可以與c-myc基因上游的淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(lymphoid enhancer-binding factor 1)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase 1)結(jié)合，控制c-myc的表達(dá)，從而調(diào)控骨髓中多潛能祖細(xì)胞的增殖[20]。PADI4作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合sox4啟動(dòng)子序列，調(diào)控其表達(dá)。而sox4可以靶向PU.1—ETS家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[4]。PU.1是調(diào)節(jié)巨噬和粒系細(xì)胞分化中的一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，決定細(xì)胞的粒系/巨噬細(xì)胞分化。因此，PADI4可以通過PADI4-Sox4-PU.1這個(gè)途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的粒系/巨噬細(xì)胞分化的功能[4]。此外，PADI4還可以通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路中p42/44蛋白磷酸化參與白血病細(xì)胞HL-60的粒系分化過程。PADI4有望成為治療白血病，調(diào)控白血病細(xì)胞分化的重要靶點(diǎn)。調(diào)控PADI4的表達(dá)水平，促進(jìn)其在白血病細(xì)胞分化中的作用將為治療白血病提供新的研究思路。但目前調(diào)控PADI4活化的上游靶分子和信號(hào)通路尚不明確。除ATRA外，是否還有其他調(diào)控PADI4促進(jìn)白血病細(xì)胞粒系分化的誘導(dǎo)劑尚待進(jìn)一步研究。

3 展 望

現(xiàn)階段白血病分化治療仍具有挑戰(zhàn)性，存在多種問題尚未解決：(1)臨床可用藥物少、機(jī)制尚不完全清楚；(2)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)藥物在臨床應(yīng)用中副作用大，效果不理想；(3)造成造血細(xì)胞分化功能異常的機(jī)制尚不完全清楚，遺傳變異是導(dǎo)致造成造血細(xì)胞分化異常和治療失敗的重要因素；(4)精準(zhǔn)靶向分化特異抗原提呈細(xì)胞具有挑戰(zhàn)性和局限性。因此，深入研究造血細(xì)胞異常分化的機(jī)制，尋找靶向調(diào)控造血細(xì)胞定向分化的新靶點(diǎn)，尋求適用于臨床應(yīng)用的靶向藥物以及誘導(dǎo)白血病細(xì)胞定向分化的新靶點(diǎn)將成為未來白血病治療研究的重點(diǎn)。近年來隨著表觀遺傳學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)研究的發(fā)展，使尋求新的高效低毒的誘導(dǎo)分化因子用于治療白血病成為可能。通過調(diào)控決定白血病細(xì)胞分化的酶或轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞特異分化，為精準(zhǔn)靶向治療白血病提供一個(gè)重要研究方向。比如是否存在特異調(diào)控PADI4的上游靶分子，使之成為靶向誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的新誘導(dǎo)分子。此外，microRNA、IncRNA在白血病細(xì)胞分化中的作用和潛在調(diào)節(jié)機(jī)制也逐漸受到關(guān)注，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控對(duì)于精準(zhǔn)靶向治療白血病具有重要意義。再者，改進(jìn)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞定向分化的治療方式方法的研究也將有助于提高白血病治療的療效。例如：協(xié)同聯(lián)合治療以加強(qiáng)誘導(dǎo)分化劑的誘導(dǎo)效果，減少機(jī)體對(duì)誘導(dǎo)分化劑的抵抗，選擇合適有效的誘導(dǎo)方法以提高分化效率等。