陳 燕，呂科良，厲 雪，高玉瑩，林玉玲，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factors，ERF)家族是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子APETALA2/ethylene responsive factor (AP2/ERF)超家族中的亞家族。在AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族中，家族成員都具有AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)AP2/ ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量,亞家族可分為3類：僅包含1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的ERF家族；含有2個(gè)重復(fù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的AP2家族；含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域和B3結(jié)構(gòu)域的RAV家族[1-2]。從1994年在擬南芥中分離的第1個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的AP2基因[3]開始，涌現(xiàn)了大量對(duì)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子全基因組家族分析，其中包括：玉米[4]、粟[5]、甜橙[6]以及葡萄[7]等。ERF家族作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族中的重要一員，已經(jīng)有大量的深入研究對(duì)ERF家族基因功能進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明，ERF能夠在各種生物脅迫與非生物脅迫下響應(yīng)，包括病害[8]、干旱[9]、鹽脅迫[10]以及通過(guò)乙烯和ABA信號(hào)通路介導(dǎo)各種生理過(guò)程[11]等發(fā)揮作用。除此之外，ERF在植物體胚發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控作用也做了相關(guān)研究。Mantiri等[12]在蒺藜苜蓿體胚發(fā)生過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)MtSERF1在球形胚以及心型胚分生組織中高表達(dá)；Piyatrakul等[13]首次揭示了AP2/ERF基因在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用，為鑒定AP2/ERF功能開辟了道路。而關(guān)于龍眼ERF(DlERF)家族的系統(tǒng)分析未見報(bào)道。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)原產(chǎn)于中國(guó)南部和越南南部的亞熱帶區(qū)域，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。龍眼具有豐富的藥理作用，具有抗氧化作用、降血糖作用以及神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用等[14]功能。研究表明，龍眼胚胎發(fā)育狀態(tài)與其果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)有著密切關(guān)系，因此對(duì)龍眼胚胎發(fā)育機(jī)理開展深入研究對(duì)龍眼產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大[15]。賴鐘雄等[16]建立的龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)被認(rèn)為是木本植物優(yōu)良的模式系統(tǒng)之一，是開展植物胚胎發(fā)育研究良好的替代材料。到目前為止，本實(shí)驗(yàn)室完成了龍眼全基因組測(cè)序[17]，為龍眼ERF全基因組分析提供了基礎(chǔ)。根據(jù)前人研究表明，在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中乙烯可能起著誘導(dǎo)體胚發(fā)生以及維持生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的作用[18]。李惠華等[19]鑒定了2個(gè)乙烯受體基因(Dl-ETR1和Dl-ERS1)，發(fā)現(xiàn)Dl-ETR1在胚性愈傷組織階段的表達(dá)量最高，心形胚階段的表達(dá)量最低，而Dl-ERS1 基因在子葉形胚的表達(dá)量最高；陳秋金等[20]分離了龍眼ERF1基因cDNA全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)DlERF1的表達(dá)量隨果實(shí)的發(fā)育逐漸上升，且施加外源乙烯能夠抑制處于果肉快速生長(zhǎng)期ERF1的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥lncRNA(DRIR)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)參與應(yīng)激反應(yīng)的一系列基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)[21]；miRNVL5與ERF4共同參與擬南芥對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)調(diào)節(jié)[22]；以及在玉米中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子被預(yù)測(cè)為miRNA的靶基因[23]。通過(guò)以上研究，推測(cè)lncRNA、miRNA能夠與ERF基因共同參與植物體的調(diào)節(jié)作用。

因此，本研究對(duì)龍眼DlERF家族成員進(jìn)行系統(tǒng)分析。首先，對(duì)龍眼基因組所有ERF家族成員進(jìn)行系統(tǒng)命名，分析其基本理化性質(zhì)、保守基序與系統(tǒng)進(jìn)化樹等基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以及所有ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期的RNA測(cè)序中的表達(dá)量。其次，通過(guò)龍眼體胚發(fā)生早期胚性愈傷組織、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)與球形胚3個(gè)階段的富集分析，篩選出5個(gè)表達(dá)差異顯著的ERF基因，驗(yàn)證其在3個(gè)階段的表達(dá)譜以及在外源乙烯處理的EC中表達(dá)模式。最后，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程3個(gè)階段(EC、ICpEC與GE)的lncRNA庫(kù)以及龍眼miRNA文庫(kù)[24]，預(yù)測(cè)DlERF家族基因與lncRNA、miRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其在體胚發(fā)生早期過(guò)程中的表達(dá)模式。以期為后續(xù)DlERF不同成員在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能鑒定提供信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的龍眼胚性愈傷組織[25]。參照賴鐘雄等[16]培養(yǎng)方法，獲得龍眼體胚發(fā)生早期胚性愈傷組織(embryonic callus, EC)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(incomplete embryonic compact structure, ICpEC)、球形胚(globular embryo, GE)。參照王亞婷等[26]的處理方法，在MS液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙烯，處理濃度分別為0、25、50、75、100和125 μg·L-1，再接入0.15 g生長(zhǎng)狀態(tài)良好的龍眼EC，3次生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)條件為25 ℃、115 r/min搖床上培養(yǎng)24 h，過(guò)濾凍存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 方 法

1.2.1龍眼ERF家族成員鑒定與基本理化性質(zhì)分析從GIGADB(http://gigadb.org)中獲取龍眼基因組氨基酸序列以及全長(zhǎng)核苷酸序列，并通過(guò)Pfam軟件分析其結(jié)構(gòu)域，鑒定出115個(gè)DlERF家族候選成員，刪除冗余序列，最終確定108個(gè)DlERF家族成員。根據(jù)擬南芥ERF家族成員在龍眼基因組中的查找注釋，參考擬南芥ERF命名方法，對(duì)龍眼ERF家族成員進(jìn)行命名鑒定。利用Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)分析DlERF家族成員的基本理化性質(zhì)。

1.2.2進(jìn)化樹分析利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，該軟件基于龍眼中ERF基因編碼的氨基酸序列比對(duì)，通過(guò)鄰接法和泊松校正等，進(jìn)行Bootstrap分析，設(shè)置參數(shù)為1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。使用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)識(shí)別ERF的AP2結(jié)構(gòu)域的精確位置，DNAMAN對(duì)龍眼ERF基因保守結(jié)構(gòu)域核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，區(qū)分ERF家族中的亞家族。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Tripure試劑盒提取總RNA，參照SMARTTMRACE cDNA Amplification KitTransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix使用說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。以cDNA 10倍稀釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，于羅氏LightCycler 480儀器中進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

采用SYBR premix Ex TaqTMⅡ kit (TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)體系為20 μL，應(yīng)用2×SYBR 10 μL，cDNA模版1 μL，上下引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。miRNA qRT-PCR采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix，反應(yīng)體系為20 μL，應(yīng)用Tip 10 μL，cDNA模版1 μL，特異與通用引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40次循環(huán)。lncRNA與mRNA以ELF-1α為內(nèi)參基因，miRNA以miR172a為體胚發(fā)生早期表達(dá)內(nèi)參基因，U6為乙烯處理表達(dá)內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT方法來(lái)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs、miRNA與DlERF關(guān)系預(yù)測(cè)以及特異性表達(dá)為了預(yù)測(cè)DlERF基因與lncRNA、miRNA之間的關(guān)系，將龍眼的ERF基因序列和miRNAs文庫(kù)提交到psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)，期望值≤5，預(yù)測(cè)出DlERF基因可能作為miRNA靶基因。再通過(guò)lncRNA鄰近的mRNA以及計(jì)算結(jié)合能的方法，篩選作為lncRNA靶基因的DlERF家族成員。最后將預(yù)測(cè)結(jié)果通過(guò)Cytoscape軟件繪制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

為進(jìn)一步了解龍眼ERF家族各成員在龍眼體胚發(fā)生早期可能發(fā)揮的功能特點(diǎn)，結(jié)合龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)DlERF家族基因在不同體胚發(fā)生早期階段特異表達(dá)的FPKM值，分析DlERF家族各成員的表達(dá)情況，并對(duì)表達(dá)差異顯著的5個(gè)DlERF基因的FPKM值與qRT-PCR表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)采用 SPSS 24軟件進(jìn)行不同表達(dá)水平之間的差異顯著性分析。利用在線網(wǎng)站Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/ heatmap)繪制熱圖、Graphpad繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼ERF家族成員鑒定與基本理化性質(zhì)分析

為了鑒定龍眼中ERF家族基因，通過(guò)Pfam軟件分析其結(jié)構(gòu)域，篩選出只有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的DlERF家族。在‘紅核子’龍眼基因組[17]中分別獲得了115個(gè)ERF的全長(zhǎng)核苷酸序列以及氨基酸序列，除去CDS相同的冗余序列，最終確定108個(gè)ERF基因的全長(zhǎng)核苷酸序列以及氨基酸序列。經(jīng)TAIR在線網(wǎng)站Blast比對(duì)，與擬南芥ERF家族成員進(jìn)化分析，對(duì)其進(jìn)行命名(表1)。

為進(jìn)一步揭示龍眼ERF家族的功能以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)DlERF家族氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析。結(jié)果(表1)表明，該家族的蛋白分子量為13.15 kD～63.49 kD，等電點(diǎn)4.53～10.82之間，不穩(wěn)定系數(shù)為31.44～96.1，親水性為-1.120～-0.284之間。龍眼ERF家族大部分氨基酸個(gè)數(shù)在300 aa以下，其中Dlo_000585.2AIL6氨基酸個(gè)數(shù)最多(575 aa)。96條DlERF基因的氨基酸序列比對(duì)到擬南芥的ERF家族成員，其中包括AtDREB26、AtTINY與AtWIND1等。值得注意的是，DlERF家族中9個(gè)成員注釋到AtERF38，8個(gè)成員注釋到AtERF22，5個(gè)成員注釋到AtERF13等。研究表明，AtERF38與脅迫相關(guān)[27]，并且被認(rèn)為是次生代謝壁的候選調(diào)節(jié)劑[28]；AtERF13位于SA、JA、ET和ABA信號(hào)通路的交界處，并通過(guò)協(xié)調(diào)這些激素增強(qiáng)植物防御反應(yīng)[29]。以上均可說(shuō)明，DlERF成員對(duì)龍眼的抗脅迫能力以及對(duì)病菌的防御能力可能起著重要作用。

續(xù)表1 Continued Table 1

續(xù)表1 Continued Table 1

2.2 DlERF家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對(duì)基因組鑒定出的108個(gè)DlERF基因，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以研究DlERF基因系統(tǒng)親緣關(guān)系。如圖1所示，根據(jù)Nakano等[30]對(duì)擬南芥的分組方式，將龍眼ERF家族分為2個(gè)亞家族：CBF/DREB(A1～A6)和ERF(B1～B6)。CBF/DREB和ERF亞家族主要區(qū)別在于AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中2個(gè)位置上氨基酸殘基，CBF/DREB亞家族第14位和第19位氨基酸分別是纈氨酸和谷氨酸,而ERF亞家族是丙氨酸和天冬氨酸[31]。其中CBF/DREB亞家族包括55個(gè)成員，ERF亞家族包括53個(gè)成員。雖然對(duì)應(yīng)于12組的節(jié)點(diǎn)的自展值都不高，但是這種分支聚類可靠性是通過(guò)內(nèi)含子的位置以及除AP2/ERF結(jié)構(gòu)域外的保守基序支撐的。

對(duì)龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的103個(gè)DlERF基因進(jìn)行外顯子分析，結(jié)果表明，103個(gè)DlERF基因中，81個(gè)基因僅包含1個(gè)外顯子，13個(gè)DlERF基因包含2個(gè)外顯子，包含3個(gè)外顯子的有3個(gè)DlERF基因，其余包含4～9個(gè)外顯子的DlERF基因均只有1個(gè)。由此可見，大部分(78.6%)龍眼ERF家族成員不含有內(nèi)含子，僅有22個(gè)DlERF基因具有內(nèi)含子，且這22個(gè)DlERF基因集中在其中4組中(A5、B2、B4與B6)。在A5組存在內(nèi)含子的成員中，除Dlo_013069.1ERF48-1外其余的成員內(nèi)含子數(shù)量均≥2，B6組存在內(nèi)含子的成員中，則除Dlo_012177.1ERF15-3外其余的成員均只包含1個(gè)內(nèi)含子。其余的8個(gè)組中DlERF基因都不含有內(nèi)含子，這也驗(yàn)證了DlERF家族的保守性。

A1～A6屬于CBF/DREB亞家族；B1～B6屬于ERF亞家族。圖1 龍眼ERF家族成員氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析A1-A6 belong to the CBF/DREB subfamily； B1-B6 belong to the ERF subfamilyFig.1 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of longan ERF family members

2.3 DlERF家族基因RNA-Seq表達(dá)量分析

為進(jìn)一步了解龍眼ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中的表達(dá)情況，本研究結(jié)合龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中3個(gè)階段(EC、ICpEC與GE)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中所有注釋為DlERF基因的FPKM值進(jìn)行分析，并制作熱圖(圖2)。除了在龍眼體胚早期3個(gè)階段不表達(dá)的13個(gè)ERF成員外，其余的95個(gè)DlERF成員均檢測(cè)到表達(dá)。

RNA-Seq分析結(jié)果顯示，DlERF家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程3個(gè)階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。表達(dá)模式總體分為三大類：第一類，31個(gè)DlERF基因在EC階段表達(dá)量最高，其中Dlo_013069.1ERF48-1、Dlo_025861.1TINY2-2、Dlo_017325.1ERF87、Dlo_004486.1ERF53-4、Dlo_015407.1WIN1、Dlo_022579.1ERF38-7、Dlo_014678.1ERF4-3、Dlo_027111.1ERF96-1、Dlo_030328.1ERF22-3、Dlo_002336.1ERF15-1與Dlo_009842.1ERF110-1在ICpEC至GE階段表達(dá)量遞減，Dlo_001352.1ERF95、Dlo_022634.1ERF22-1、Dlo_016788.1ERF22-6、Dlo_022353.1ERF9-1與Dlo_030665.1ERF22-8在ICpEC至GE階段表達(dá)量遞增，而其余的成員在ICpEC到GE階段表達(dá)量變化不大，說(shuō)明其余的15個(gè)DlERF基因在EC階段高表達(dá)，可能對(duì)胚性愈傷組織的維持起作用。第二類，11個(gè)DlERF在ICpEC階段表達(dá)量最高，除Dlo_019371.1ERF2-1、Dlo_018664.1WIND1-2與Dlo_004403.1ERF2-3外，其余的8個(gè)在EC與GE階段的表達(dá)量無(wú)明顯變化，說(shuō)明了在ICpEC階段的調(diào)控作用最為明顯。第三類，53個(gè)DlERF基因在GE階段表達(dá)量最高，Dlo_026157.1ERF73-2、Dlo_014299.1ERF13-3、Dlo_022613.1ERF5-1、Dlo_023524.1ERF71-2、Dlo_005616.1CBF3、Dlo_023666.1ERF8、Dlo_022612.1ERF1-2與Dlo_007317.1ERF38-2在EC至ICpEC階段表達(dá)量遞減，Dlo_013163.1DREB2、Dlo_010734.1ERF3-2、Dlo_007513.1ERF70-3、Dlo_025226.1ERF70-4、Dlo_017388.1ERF10-2、Dlo_000290.1ERF70-1與Dlo_000247.1ERF4-1在EC至ICpEC階段表達(dá)量遞增，其余的在EC與ICpEC階段表達(dá)量變化不大。以上結(jié)果表明，不同的DlERF基因可能參與龍眼體胚發(fā)生早期不同階段的維持。

EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu); GE.球形胚圖2 龍眼ERF家族在龍眼體胚早期3個(gè)階段的特異表達(dá)分析EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryoFig.2 Specific expression analysis of longan ERF family in three stages of early longan somatic embryo

總體而言，龍眼ERF家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，大部分成員在GE階段高表達(dá)，特別是在個(gè)別階段表現(xiàn)出階段特異性的DlERF基因，可能在該階段對(duì)形態(tài)功能等的維持起到了一定作用。

2.4 龍眼體胚發(fā)生早期DlERF基因表達(dá)的qRT-PCR分析及乙烯處理下的表達(dá)

為了更好地了解ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期的可能調(diào)控作用，通過(guò)在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段(EC、ICpEC與GE)RNA-Seq表達(dá)兩兩對(duì)比，篩選出在龍眼體胚發(fā)生早期表達(dá)差異顯著的5個(gè)ERF基因(Dlo_008317.1ERF15-2、Dlo_009070.1ERF106-3、Dlo_022634.1ERF22-1、Dlo_009939.1ERF98與Dlo_022310.1ERF1-1)。qRT-PCR分析5個(gè)DlERF的表達(dá)趨勢(shì)(圖3，A)與RNA-Seq的表達(dá)結(jié)果(圖3，B)進(jìn)行對(duì)比。由圖3可以看出，除Dlo_022634.1ERF22-1外，其余4個(gè)DlERF從EC到GE階段，RNA-Seq與qRT-PCR中的整體表達(dá)趨勢(shì)一致。Dlo_008317.1ERF15-2、Dlo_022310.1ERF1-1與Dlo_009939.1ERF98在GE階段qRT-PCR中的表達(dá)量顯著高于EC與ICpEC階段;Dlo_009070.1ERF106-3則在EC階段qRT-PCR中的表達(dá)量最高，顯著高于GE與ICpEC階段;Dlo_022634.1ERF22-1在ICpEC階段表達(dá)量顯著高于EC與GE階段。從不同表達(dá)趨勢(shì)來(lái)看，DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程不同階段都發(fā)揮了作用。

A. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR；B. RNA測(cè)序；EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu); GE.球形胚；不同小寫字母表示階段間差異顯著(P<0.05)圖3 DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段的表達(dá)A. qRT-PCR; B. RNA Seq; EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryo; The normal letters indicate significant differences among different stages (P <0.05)Fig.3 Expression of DlERF in the early three stages of longan somatic embryogenesis

使用qRT-PCR研究了DlERF在不同濃度乙烯處理下的表達(dá)(圖4)。在不同乙烯濃度24 h處理下，5個(gè)DlERF基因均表現(xiàn)出差異的表達(dá)模式。與對(duì)照(CK)相比，不同梯度濃度的乙烯處理使得DlERF基因顯著下調(diào)，雖然Dlo_022310.1ERF1-1、Dlo_009939.1ERF98與Dlo_022634.1ERF22-1在乙烯處理濃度50 μg·L-1以及Dlo_008317.1ERF15-2乙烯處理濃度為125 μg·L-1時(shí)表達(dá)量顯著上升，但總體仍為負(fù)調(diào)控趨勢(shì)。

2.5 DlERF家族成員與lncRNA、miRNA之間的關(guān)系預(yù)測(cè)與表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)lncRNA鄰近的mRNA以及計(jì)算結(jié)合能的方法對(duì)lncRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，本次對(duì)108個(gè)DlERF進(jìn)行l(wèi)ncRNA的靶基因預(yù)測(cè)。5個(gè)不同的DlERF基因分別被預(yù)測(cè)為L(zhǎng)TCONS_00052840、LTCONS_00055212、LTCONS_00016255、LTCONS_00013739與LTCONS_00043464的靶基因。5個(gè)DlERF基因都屬于lncRNA的順式調(diào)控靶基因，其中除了LTCONS_00043464與對(duì)應(yīng)DlERF基因位置關(guān)系為lncRNA位于mRNA上游10 k內(nèi)外，其余的4個(gè)均為lncRNA位于mRNA下游20k內(nèi)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)圖4 不同乙烯濃度處理下DlERF的表達(dá)模式The normal letters indicate significant differences among treatments (P <0.05)Fig.4 Relative expression pattern of DlERF in different ethylene concentrations

利用psRNATarget 在線預(yù)測(cè)(期望值≤5)，預(yù)測(cè)龍眼 miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中靶向調(diào)控DlERF家族成員的miRNA。結(jié)合DlERF與相關(guān)lncRNA、miRNA的關(guān)系預(yù)測(cè)，構(gòu)建了龍眼體胚發(fā)生早期差異顯著的ERF-lncRNA-miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖5，A)。分析結(jié)果表明，Dlo_009070.1ERF106-3、Dlo_009939.1ERF98、Dlo_008317.1ERF15-2與Dlo_022310.1ERF1-1均同時(shí)被2個(gè)miRNA調(diào)控，且Dlo_008317.1ERF15-2能作為L(zhǎng)TCONS_00013739的靶基因。值得注意的是，Dlo_miR413能夠同時(shí)調(diào)控Dlo_009070.1ERF106-3與Dlo_008317.1ERF15-2。

使用qRT-PCR分析了5個(gè)DlERF以及相關(guān)lncRNA、miRNA在EC、ICpEC與GE中的表達(dá)模式(圖5，B)。結(jié)果表明， LTCONS_00013739對(duì)靶基因Dlo_008317.1ERF15-2為正調(diào)控關(guān)系，從EC到GE階段表達(dá)量顯著升高；在EC至ICpEC階段以及ICpEC至GE階段，Dlo_miR164a通過(guò)靶向Dlo_022634.1ERF22-1負(fù)調(diào)控其表達(dá)；Dlo_miR413與Dlo_miR1510a共同靶向Dlo_009070.1ERF106-3，從EC到GE階段均表現(xiàn)出顯著負(fù)調(diào)控關(guān)系，而Dlo_miR413與Dlo_008317.1ERF15-2的表達(dá)量表現(xiàn)出正相關(guān)，推測(cè)相比于Dlo_008317.1ERF15-2，Dlo_miR413更傾向于調(diào)控Dlo_009070.1ERF106-3；調(diào)控Dlo_009939.1ERF98相關(guān)的Dlo_miR408與Dlo_miR774b，從表達(dá)趨勢(shì)來(lái)看，Dlo_miR774b在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程能負(fù)調(diào)控Dlo_009939.1ERF98；Dlo_miR399c與Dlo_022310.1ERF1-1在EC到GE階段可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

使用qRT-PCR研究了DlERF及其相關(guān)的miRNA、lncRNA在不同濃度乙烯處理下的表達(dá)(圖6)。結(jié)果表明，Dlo_miR413在不同濃度乙烯處理均沒有差異。乙烯處理對(duì)LTCONS_00013739與其靶基因Dlo_008317.1ERF15-2表現(xiàn)出顯著抑制作用；Dlo_022634.1ERF22-1 及Dlo_miR164a在從75、100至125 μg·L-1乙烯處理下表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控關(guān)系；與對(duì)照(CK)相比，Dlo_miR1510a在75 μg·L-1乙烯處理下表達(dá)量顯著上升，與其靶基因Dlo_009070.1ERF106-3則表現(xiàn)相反趨勢(shì)；除CK外，Dlo_009939.1ERF98在50 μg·L-1乙烯處理下表達(dá)量最高，與其相關(guān)的Dlo_miR774b則在50 μg·L-1乙烯處理下表達(dá)量最低，表現(xiàn)出顯著的抑制作用；與CK相比，Dlo_022310.1ERF1-1在125 μg·L-1乙烯處理下表達(dá)量顯著下降，與其相關(guān)的Dlo_miR399c則顯著上升。根據(jù)前面對(duì)DlERF及其相關(guān)的miRNA、lncRNA在體胚發(fā)生早期的表達(dá)趨勢(shì)分析對(duì)比可知，大部分的DlERF及其相關(guān)的miRNA、lncRNA在不同濃度乙烯處理下仍然表現(xiàn)出相同的調(diào)控趨勢(shì)。

龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中，ERF基因及可能對(duì)其起到調(diào)控作用的miRNA、lncRNA的不同作用模式，以及在不同階段、不用濃度乙烯處理中的差異表達(dá)，表明了DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中可能存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu); GE.球形胚圖5 龍眼體胚發(fā)生早期差異表達(dá)的ERF基因與其相關(guān)的miRNA、lncRNA的表達(dá)趨勢(shì)EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryoFig.5 Trends of expression of ERF genes and their associated miRNAs and lncRNAs in the early stage of longan somatic embryogenesis

圖6 不同乙烯濃度處理下DlERF基因與其相關(guān)的miRNA、lncRNA的表達(dá)趨勢(shì)Fig.6 Trends of expression of DlERF genes and their associated miRNAs and lncRNAs in different ethylene concentrations

3 討 論

3.1 龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中大量的ERF基因在GE階段高表達(dá)

AP2/ERF是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育[32-33]、基因表達(dá)[34]以及生物[35]與非生物脅迫[36]等方面發(fā)揮重要作用，并且在植物體胚發(fā)生過(guò)程中也起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[13]。然而在龍眼ERF全基因組家族還未進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，大多數(shù)DlERF基因在龍眼中的功能和作用仍然未知。

Nakano等[30]對(duì)擬南芥與水稻ERF家族進(jìn)行全基因組分析，包括基因結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育，染色體位置和保守基序等。因此本研究對(duì)龍眼ERF家族進(jìn)行系統(tǒng)地分析，從龍眼數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了108個(gè)ERF家族基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建以及保守基序分析表明，108個(gè)ERF家族基因具有相同的保守基序，AP2/ERF結(jié)構(gòu)域在龍眼中相對(duì)最為保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹節(jié)點(diǎn)的自展值相對(duì)較低，基于DlERF保守基序分析，推測(cè)除AP2/ERF結(jié)構(gòu)域之外，其余部分成員間差距較大。對(duì)5個(gè)在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中富集的ERF基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，由于AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中2個(gè)位置上氨基酸殘基的差距，5個(gè)龍眼體胚發(fā)生早期差異表達(dá)DlERF基因?qū)儆贓RF家族中的2個(gè)亞家族。研究表明在擬南芥ERF家族成員中，AtERF1能夠在非生物脅迫下扮演正調(diào)控的角色[37]；AtERF15不僅是ABA響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子，并且在根與胚胎中高度表達(dá)[38]；以及AtERF98能夠調(diào)節(jié)植物重要抗氧化劑生物合成，有助于提高擬南芥的耐鹽性[39]?？梢姡邶堁垠w胚發(fā)生早期過(guò)程中差異表達(dá)的ERF基因可能對(duì)提高龍眼抗逆性起到十分重要的作用，并且Dlo_022310.1ERF1-1、Dlo_008317.1ERF15-2與Dlo_009939.1ERF98在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。這也進(jìn)一步說(shuō)明， 隨著龍眼體胚發(fā)生早期進(jìn)行，內(nèi)源激素[40]等方面發(fā)生顯著變化，為了促進(jìn)胚胎的正常發(fā)育，需要更多的DlERF基因參與。

在本次研究中，為了鑒定龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中ERF基因的表達(dá)模式，對(duì)101個(gè)在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程檢測(cè)到表達(dá)的ERF基因進(jìn)行RNA-Seq表達(dá)分析。大部分DlERF基因在GE階段表達(dá)量最高，其次是EC階段。Boutilier等[41]與Tsuwamoto等[42]鑒定一些AP2/ERF基因能夠促進(jìn)胚胎發(fā)育，并推測(cè)他們?cè)赟E的誘導(dǎo)過(guò)程中具有特定的功能。通過(guò)對(duì)5個(gè)在龍眼體胚發(fā)生早期差異顯著表達(dá)的DlERF基因進(jìn)行qRT-PCR與RNA-Seq表達(dá)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大部分在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段的表達(dá)趨勢(shì)一致，且其中3個(gè)DlERF基因在龍眼GE階段表達(dá)量最高。與蒺藜苜蓿體胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的MtSERF1相同趨勢(shì)，在球形胚分生組織中高表達(dá)[12]。由此可見，從EC到GE階段需要更多的ERF基因來(lái)參與GE階段的維持，也進(jìn)一步說(shuō)明在體胚發(fā)生早期過(guò)程中，細(xì)胞分裂分化、抗性等方面也逐漸增強(qiáng)。

3.2 DlERF基因與乙烯之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系并且可能與miRNA、lncRNA形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

乙烯在體胚發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用[43-44]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在龍眼體胚發(fā)生發(fā)育的過(guò)程中，乙烯含量在不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)與心形胚分別出現(xiàn)了峰值，松散型的胚性愈傷組織、球形胚以及子葉形胚的表達(dá)量相對(duì)較低[18]。同樣也有研究表明，對(duì)于依賴 GCC-box 表達(dá)的ERF基因來(lái)說(shuō)，既可以是轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以是轉(zhuǎn)錄抑制子，并且只有一小部分受乙烯調(diào)節(jié)[45]。因此對(duì)龍眼EC使用不同濃度乙烯處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，與CK相比，在不同濃度處理下5個(gè)DlERF基因均表現(xiàn)為顯著下調(diào)。結(jié)果表明，乙烯與龍眼體胚發(fā)生早期5個(gè)差異表達(dá)的ERF基因存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。另一方面，5個(gè)DlERF基因在外源乙烯處理下的表達(dá)趨勢(shì)是相似的，這意味著這5個(gè)DlERF基因可能在應(yīng)對(duì)外源不同濃度乙烯處理時(shí)產(chǎn)生類似的響應(yīng)，也進(jìn)一步表明其功能保守性。

除了與基因相互作用外，ERF基因也可能與miRNA、lncRNA相互作用。目前，lncRNA在植物體胚發(fā)生過(guò)程調(diào)控作用的研究還未見報(bào)道，但是關(guān)于植物中l(wèi)ncRNAs的研究已有部分研究，多數(shù)以模式植物[46-47]與水稻[48]等作物為研究對(duì)象。但對(duì)于miRNA來(lái)說(shuō)，已經(jīng)在龍眼中做了大量的研究，例如：Dlo_miR156家族成員與早期胚胎培養(yǎng)發(fā)育階段相關(guān)[49]，Dlo_miR162與多個(gè)miRNA共同調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)育的特定階段[50]等。分析結(jié)果顯示，一個(gè)DlERF可能被多個(gè)miRNAs靶向，一個(gè)miRNA也可能靶向多個(gè)DlERF基因。通過(guò)對(duì)龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中以及不同濃度乙烯處理下差異表達(dá)5個(gè)ERF基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，不僅初步驗(yàn)證了DlERF基因與其相關(guān)的miRNA、lncRNA可能存在的調(diào)控關(guān)系，同時(shí)推測(cè)對(duì)于2個(gè)miRNA同時(shí)調(diào)控同一個(gè)DlERF基因，并且miRNA對(duì)DlERF的調(diào)控作用具有偏好性。因此認(rèn)為可能由于存在多個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致其難以從表達(dá)量中發(fā)現(xiàn)其調(diào)控趨勢(shì)。從復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中可以看出，作為生物與非生物脅迫相關(guān)的基因，在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，以上研究?jī)H僅是DlERF基因與lncRNAs、miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的冰山一角，在龍眼體胚發(fā)生早期過(guò)程中，DlERF所發(fā)揮的功能以及調(diào)控作用需要在今后的工作中進(jìn)行研究驗(yàn)證。